РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2011, том 51, № 3, с. 352-356
-- УФ-ОБЛУЧЕНИЕ
УДК [57+61]::539.1.047:612:591.111.2:535-3
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОЛЕКУЛ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕМОГЛОБИНА И ЕГО СОСТАВНЫХ ЧАСТЕЙ (ГЕМА И ГЛОБИНА), ПОДВЕРГНУТЫХ ВОЗДЕЙСТВИЮ ВАКУУМНОГО УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ © 2011 г. А. А. Пантявин, А. К. Ишеева, В. Г. Артюхов*
Воронежский государственный университет
Цель настоящей работы — изучение закономерностей действия вакуумного ультрафиолетового (ВУФ) излучения на оптические и хроматографические характеристики молекул гемоглобина, гема и глобина, полученных из оксигемоглобина человека. В работе использовали тонкие пленки названных молекул толщиной 0.1—0.5 мкм. Облучение полученных образцов проводили с применением специально созданной для этих целей установки, включающей в качестве источника ВУФ-излу-чения лампу барьерного разряда в аргоне. Методами спектрофотометрии и тонкослойной хроматографии проанализированы структурные модификации молекул гемоглобина, гема и глобина, индуцированные воздействием ВУФ-света (длины волны от 118 до 134 нм) в дозе 1.2 кДж/м2. Показано, что при облучении пленок гемоглобина в области светопоглощения хромофоров карбоксильных групп белковой молекулы происходит переход железа из двухвалентного в трехвалентное состояние. При облучении молекул глобина в дозе 1.2 кДж/м2 регистрируется достоверное снижение ин-тенсивностей полос поглощения в области от 275 до 250 нм и наблюдается увеличение хроматографической подвижности молекул, что свидетельствует в пользу представления об изменении структурного состояния белковой молекулы вследствие ее разворачивания и утраты глобулярной структуры. После воздействия ВУФ-света в дозе 1.2 кДж/м2 на гемовую часть молекулы гемоглобина достоверных изменений оптических и хроматографических характеристик гема зафиксировано не было. Таким образом, ВУФ-излучение в области светопоглощения хромофоров карбоксильных групп индуцирует нарушение высших типов пространственной организации молекул глобина, приводящие к изменению структурного состояния белковой глобулы. В то же время ВУФ-свет в малой дозе не приводит к изменению структурного состояния выделенного гема из-за отсутствия хромофоров в небелковой части, ответственных за поглощение квантов ионизирующего ВУФ-излучения.
Гемоглобин человека, гем, глобин, вакуумное ультрафиолетовое излучение, хромофоры, карбоксильная группа, пептидная группа, фотоионизация, спектр поглощения, лампа барьерного разряда, энергетическая экспозиция.
Поскольку вакуумный ультрафиолетовый свет наименее изученная часть солнечного спектра, то исследование механизмов его действия на биологические объекты представляет значительный интерес для исследователей. Так как вакуумное УФ-излучение (ВУФ, X < 200 нм) является ионизирующим с энергией квантов 6—120 эВ, что превышает потенциалы ионизации большинства атомов, входящих в состав белков, следует ожидать конформационных изменений и деструктивных процессов в составе белковых молекул после его действия. В период, предшествующий возникновению жизни, наша планета из-за отсутствия озонового пояса подвергалась воздействию излучений всего электромагнитного спектра
* Адресат для корреспонденции: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, Воронежский гос. ун-т, биолого-почвенный фак-т, каф. биофизики и биотехнологии; тел.: (4732) 20-85-86; факс: (4732) 20-83-08; e-mail: avg@main.vsu.ru.
Солнца, что создавало большие возможности для абиогенного синтеза органических соединений. Есть основания предполагать, что ВУФ-свету принадлежит ведущая роль в синтезе первых органических соединений, а затем и в возникновении первых организмов [1—3].
Большинство работ, посвященных биологическому действию ВУФ-излучения на молекулярном уровне, выполнено с использованием в качестве объектов исследования нуклеиновых кислот и их компонентов [4—7]. Особенностям взаимодействия ВУФ-излучения с белковыми системами уделено со стороны исследователей гораздо меньше внимания. Практически не обсуждался вопрос о взаимосвязи дозозависимых структурных перестроек молекул белка с изменением их функциональной активности после ВУФ-облуче-ния, не определено соотношение вкладов тех или иных фотохимических процессов в эффектах
ВУФ модификации белковых макромолекул. По этой причине анализ экспериментальных данных, касающихся фотохимических изменений белковых молекул, индуцированных ВУФ-излу-чением, позволит наметить некоторые модельные подходы к установлению возможных путей эволюции структуры этих биологически важных молекул.
Фотохимические процессы, происходящие в белках под действием УФ-света в спектральной области 200—400 нм, изучались многими авторами [8—11]. В вакуумной УФ-области спектра с X < 200 нм эти процессы практически не исследованы. Действие УФ-излучения в указанном диапазоне длин волн и ВУФ-излучения на белковые системы может различаться первичными фотофизическими процессами и, следовательно, привести к образованию неодинаковых конечных фотопродуктов и к инактивации белковых молекул [12].
Изучение фотохимических изменений свободных гема и глобина может дать полезные сведения об их роли в фотопревращении молекул гемоглобина при УФ-облучении; также в литературе очень мало работ, посвященных выяснению локализации и природы структурных нарушений в молекулах гема и глобина после облучения растворов этих компонентов гемсодержащего белка [11].
Исходя из вышеизложенного, нами проведены систематические исследования структурных фотомодификаций гема и глобина, выделенных из оксигемоглобина человека, под влиянием ВУФ-света. Это продиктовано значительным содержанием гемоглобина среди всех белковых компонентов крови, известной структурной организацией и важностью его функции транспорта различных низкомолекулярных лигандов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Для приготовления растворов оксигемоглоби-на человека в концентрациях 5 х 10—6—10-5 моль/л в бидистиллированной воде, этот белок выделяли по методу, описанному D.L. Drabkin [13] с модификациями Л.А. Блюменфельда [14]. В основе метода лежит явление гемолиза эритроцитов под действием воды. Для получения гема к раствору оксигемоглобина человека прибавляли равное количество охлажденной солянокислой смеси Кларка и Лэбса с рН 1.4 (0.2 н KCl + 0.2 н HCl), которая вызывает переход белка в метформу с последующим распадом молекул гемопротеида на глобин и гемин.
Пленки изучаемых соединений получали высушиванием солянокислых (pH 1.4) растворов в концентрациях 5 х 10-6—10~5 моль/л в объеме 10 мкл на подложках MgF2 (диаметр 30 мм, тол-
Таблица 1. Соотношение интенсивностей полос поглощения гемоглобина в УФ-области спектра до и после ВУФ-облучения (118—134 нм) в дозе 1.2 кДж/м2
Доза облучения, кДж/м2 275/250 (n = 8) 342/305 (n = 8)
0 0.95 ± 0.01 1.43 ± 0.01
1.2 0.95 ± 0.01 1.32 ± 0.01
щина 1 мм). Толщина пленок оксигемоглобина, гема и глобина, измеренная при помощи интерференционного микроскопа "МИИ-4" ("ЛО-МО", Россия), составляла 0.1—0.5 мкм.
Облучение образцов проводили светом лампы барьерного разряда в инертном газе (аргоне) в диапазоне длин волн 118—134 нм [15] с помощью установки, собранной на кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета
[16]. Поток излучения разряда в газе, падающий на образец, составлял 10 Вт/м2.
Измерение спектров поглощения молекул указанных соединений проводили на спектрофотометре "СФ-46" в области длин волн 250—630 нм через 1 нм. Подложку MgF2 с нанесенным на нее образцом помещали в спектрофотометрическую ячейку, которая находилась в кюветном отделении прибора. Контролем служила подложка MgF2 без образца.
Для определения хроматографической подвижности Rf продуктов ВУФ радиолиза применялся метод тонкослойной хроматографии (ТСХ)
[17] с использованием пластинок для ТСХ "суль-фол 150*156". В качестве растворителя для восходящей хроматографии ипользовали смесь № 1 (уксусная кислота, бутанол, вода в соотношении 1 : 1 : 4). Исследуемые образцы (необлученные и после ВУФ-облучения) наносили на пластинку для ТСХ, после чего проводили их разделение в течение 30—40 мин и выдерживали в сушильном шкафу при температуре 40°С в течение получаса. Высушенная пластинка являлась хроматограм-мой исследуемых веществ. Значение Rf определяли как отношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию, пройденному фронтом растворителя.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Нами выявлено, что после облучения тонких пленок гемоглобина светом аргоновой лампы в дозе 1.2 кДж/м2 наблюдается статистически достоверное снижение интенсивности полос поглощения от 342 до 305 нм, что свидетельствует в пользу представления о деструкции железопор-фиринового кольца (табл. 1).
Установлено, что при использовании экспозиции света аргоновой лампы 1.2 кДж/м2 происходит статистически достоверное снижение интен-
Таблица 2. Соотношение интенсивностей полос поглощения гемоглобина в видимой области спектра до и после ВУФ-облучения (118—134 нм) в дозе 1.2 кДж/м2
Доза облучения, 412/405 542/500 576/560 630 нм
кДж/м2 п = 8 п = 8 п = 8 п = 8
0 1.300 ± 0.010 1.470 ± 0.010 1.110 ± 0.01 0.013 ± 0.030
1.2 1.020 ± 0.010 1.510 ± 0.020 0.610 ± 0.010 0.022 ± 0.030
сивности полос поглощения с ктах = 412 нм (ок-сиформа) к значениям, характерным для метформы гембелка (ктах 405 нм), что свидетельствует о накоплении в изучаемом образце метге-моглобина. В пользу этого представления свидетельствует также факт уменьшения соотношения интенсивностей полос поглощения с ктах = 576 к 560 нм и увеличение значения отношеня интенсивностей 542/500, а также интенсивности полосы поглощения при 630 нм, характерной для мет-формы гемоглобина (табл. 2).
Установлено, что после облучения светом аргоновой лампы барьерного разряда "АрБФ-10" (ктах = 126 нм) в дозе 1.2 кДж/м2 статистически достоверных изменений соотношения интенсивности полос поглощения в гемовых образцах по сравнению с контролем (необлученная пленка) не происходит. Это связано, по-видимому, с отсутствием хромофоров в небелковой части, ответственных за поглощение квантов ионизирующего ВУФ-излучения.
Показано, что при использовании энергетической экспо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.