РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 4, с. 367-376
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ
УДК [57+61]::539.1.04:615.83
ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩИХ СВОЙСТВ 3,3-ДИЭТИЛТИАКАРБОЦИАНИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ
© 2014 г. |В. М. Андреев!1, Н. В. Кузнецова1, А. Б. Шевелев2, Ю. К. Кудыкина2*, М. А. Гусева2,
А. С. Епремян3, Е. С. Лисицына1, В. А. Кузьмин1
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, Москва 3Научно-производственный центр "Армбиотехнология" НАНРеспублики Армения, Государственная некоммерческая организация, Ереван
Целью работы было исследование перспектив использования 3,3'-диэтилтиакарбоцианина (3,3'-ДЭТКЦ) в качестве фотосенсибилизатора для лечения вирусных инфекций методом фотодинамической терапии. Модельным объектом для изучения фотоинактивации служил фаг РМ-2 Pseudoalteromonas взре^апа, содержащий липидный компонент в составе капсида. Испытания проводили на установке, моделирующей условия освещения при проведении фотодинамической терапии (ФДТ) с помощью неочищенного фагового лизата. Показано, что 3,3'-ДЭТКЦ в составе фаго-лизата, но не в воде, при освещении деградирует со значительной скоростью. При концентрации красителя от 0.5 мкмоль/л до 9.0 м моль/л начальная скорость фотоинактивации пропорциональна квадрату концентрации красителя, что подтверждает гипотезу о том, что фотохимически активной формой красителя в этих условиях является димер. Показана повышенная способность красителя к димеризации в фаговом лизате: константа диссоциации димеров в нем оказалась на порядок ниже, чем в воде. Показано также образование аддукта красителя с материалом фаголизата, имеющего ^тах = 594 нм и представляющего собой высокополимер, осаждаемый низкоскоростным центрифугированием.
Карбоцианин, тиакарбоцианин, фотоинактивация, фотосенсибилизатор, синглетный кислород, бактериофаг, PM-2, Pseudoalteromonas espejiana.
DOI: 10.7868/S0869803114040043
В настоящее время фотодинамическая терапия (ФДТ) применяется на практике исключительно в качестве инструмента для лечения онкологических заболеваний. Однако благодаря разработке методов адресной доставки фотосенсибилизаторов in vivo этот метод может эффективно использоваться и для поражения инфекционных агентов различной природы. Особенно актуальна разработка методов лечения вирусных заболеваний, большинство из которых, в отличие от бактериальных инфекций, не удается купировать никакими медикаментозными средствами, или достигаемый эффект носит условный характер.
Тиакарбоцианиновые красители (ТКЦК) могут рассматриваться в качестве перспективного класса фотосенсибилизаторов для лечения инфекционных заболеваний. Они представляют собой симметричные молекулы, имеющие в своем
* Адресат для корреспонденции: 142782 Москва, поселение Московский, пос. Ин-та полиомиелита, 27 км Киевского ш.; тел.: 8 (495) 841-90-50; 8 (909) 682-85-61; e-mail: kudykina_yuliya@mail.ru.
составе два идентичных кластера из конденсированных пяти- и шестичленного колец, соединенных полиметиновым мостиком. В составе пяти-членного кольца имеются атомы серы и азота, при последнем из которых в положении 3 (3') находится алкильный заместитель варьирующей длины.
Несмотря на популярность в качестве объекта фотохимических исследований, до настоящего времени ТКЦК не нашли применения в фотодинамической терапии, что можно объяснить их малой растворимостью в водных средах и чрезвычайно низким квантовым выходом синглетного кислорода для мономерной формы этого типа красителей — <0.1% [1]. Формирование димеров и ^агрегатов ТКЦК в концентрациях 0.5—10 мкмоль/л приводит к повышению эффективности флуоресценции на 2 порядка и более. Образование надмолекулярных форм ТКЦК может эффективно стимулироваться и направляться биомакромолекулами: белками, липидами и нуклеиновыми кислотами. Именно это свойство может обеспечивать адресность взаимодействия ТКЦК с виру-
N i
I- Et
N i
Et
Рис. 1 Структурная формула 3,3'-диэтилтиакарбоциа-нина (3,3'-ДЭТКЦ).
сами или клетками, несущими на своей поверхности белки.
В основе безизлучательного механизма тушения флуоресценции ТКЦК лежит их фотоинду-цированная изомеризация из транс- в цис-форму. Короткие алкильные заместители (метил или этил), не препятствующие этому процессу, не обеспечивают ТКЦК в мономерной форме максимального квантового выхода флуоресценции и синглетного кислорода по сравнению с более длинными алкильными цепями. Кроме того, они придают ТКЦК высокую темновую токсичность в отношении всех типов эукариотических клеток, что косвенно указывает на их недостаточно селективное взаимодействие с биомакромолекулами [2]. Напротив, более протяженные алкилы (С7-С8), не позволяя ТКЦК эффективно флуоресцировать в водных растворах, облегчают ком-плексообразование ТКЦК с биомакромолекулами. Однако они снижают и без того невысокую растворимость ТКЦК в водных средах, способствуя образованию димеров и мультимеров, включая J-агрегаты.
В работе [3] современными методами показано, что на стабильность и скорость формирования J-агрегатов влияют также органические и неорганические катионы, прежде всего Na+, выполняющие функцию противоиона и необходимые для преодоления электростатического взаимного отталкивания молекул ТКЦК. Таким образом, можно ожидать, что солевой состав биологических сред может оказывать влияние на эффективность фотосенсибилизации ТКЦК in vivo.
С учетом изложенного выше, в рамках настоящей работы была поставлена цель исследовать эффективность фотосенсибилизации 3,3'-диэти-лтиакарбоцианина (3,3'-ДЭТКЦ, рис. 1) в отношении модельного объекта — бактериофага PM-2. Выбор этого объекта обусловлен тем, что в его составе имеются липиды, что приближает его по свойствам к оболочечным вирусам человека и животных. Поскольку хозяином данного фага является тихоокеанская бактерия Pseudoalteromonas espejiana, этот фаг проявляет высокую галотоле-рантность по сравнению с более охарактеризованными фагами энтеробактерий [4]. Геном фага
PM-2 полностью секвенирован [5]. Имеется детальная характеристика его белкового и липидно-го состава, механизма проникновения в клетку бактерии-хозяина [6]. Имеются также данные о его использовании в качестве модели для исследования фотосенсибилизации. Однако подобная работа выполнялась на очищенных препаратах бактериофага [7].
Задачами работы были:
1. Оптимизация условий моделирования ФДТ с использованием неочищенных лизатов фага PM-2 (подготовка устойчивых при хранении и манипуляциях маточных растворов 3,3'-ДЭТКЦ и фаговых лизатов, количественное определение и оптимизация интенсивности уровня освещенности, разработка методики остановки реакции и оценка величины фотоинактивации (ФИ)).
2. Изучение влияния солевого состава и гетерогенных примесей биомакромолекул в составе неочищенного фагового лизата на динамику и полноту ФИ фага PM-2.
3. Исследование роли синглетного кислорода в ФИ фага PM-2 с помощью 3,3'-ДЭТКЦ при титровании реакционной смеси азидом натрия (агентом, захватывающим и инактивирующим синглетный кислород).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Бактериофаг РМ2 и его хозяин — морская бактерия Pseudoalteromonas espejiana BAL-31 были получены из ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов в 1976 г. [8].
Среда для выращивания бактерий, получения и разбавления лизатов — BAL-бульон (450 ммоль/л NaCl, 9.4 ммоль/л KCl, 50 ммоль/л MgSO4, 10 ммоль/л CaCl2, 8 г пептона на 1 л среды, pH 7.6 [9]).
Титрование фага. Фаг РМ2 титровали в основном, как описано в работе [9]. К 2 мл расплавленного верхнего агара (0.45% бактоагара на BAL-бу-льоне) после охлаждения в течение 3 мин в термостате до 39°С добавляли 200 мкл ночной культуры бактерий и 100 мкл необходимого для разбавления образца, смесь быстро перемешивали и выливали на чашку с нижним агаром (около 20 мл 1%-ного бактоагара на BAL-бульоне). Чашки инкубировали при комнатной температуре. Бляшки колоний фага начинали появляться уже после 6— 7 ч инкубации. Титром фага (Т) в образце называли число бляшек или БОЕ (бляшкообразующих единиц), отнесенное к 1 мл образца.
Получение и свойства лизатов. В чашку Петри с нижним агаром или без агара наливали BAL-бу-льон, добавляли бактерии из ночной культуры —
Лизаты и их свойства
Номер лизата Дата получения лизата Начальный титр фага, БОЕ • мл 1 Скорость инактивации при хранении, w^
1 17.06.2007(+) 2.24 х 1010 (1.46 + 0.06) х 10-2 сут-1
2 15.01.2009(+) 1.65 х 1010 (1.79 + 0.08) х 10-2 сут-1
3 9.07.2009(-) 3.5 х 1010 (5.32 + 0.20) х 10-2 сут-1
4 2.09.2009(+) 2.0 х 1010 (0.49 + 0.19) х 10-2 сут-1
Примечание. (+) указывает, что лизат получен над агаром, (—) — без агара. Стабильность фага при хранении и возраст лизата влияли на кинетику фотоинактивации.
обычно в количестве около 108 жизнеспособных бактерий или КОЕ (колониеобразующих единиц) — и фаг РМ2 с низкой множественностью инфекции (10-2—10—3 БОЕ на 1 КОЕ). Инкубацию проводили при комнатной температуре до следующего утра (лизис культуры обычно проходил ночью). Лизат центрифугировали 20 мин при 3000 g для удаления крупных обломков бактерий и клеток, резистентных к фагу, затем фильтровали и собирали в стерильную пробирку (размер пор фильтра 0.22 мкм) и хранили в холодильнике. При хранении фаг в лизате постепенно инактивируется по экспоненциальному закону T = T0 х 10-wt, где скорость инактивации фага w = —А lg T/At, сут-1. В настоящей работе было использовано 10 лизатов, для которых значение w варьировало от 0.49 х 10-2 до 5.89 х 10-2 сут-1 (соответствующие "времена полураспада" инфекционного фага составляли от 61.2 до 5.09 сут), однако наиболее важные результаты были получены с четырьмя лизатами, основные свойства которых перечислены в таблице.
Источником света для фотоинактивации служили галогеновые лампы накаливания КГМ-12-100 или КГМ-9-70. Лампу питали от источника постоянного тока ВСА-5К. Свет от лампы, прошедший через водяной фильтр, фокусировали сверху на открытую пробирку ("Eppendorf", Германия), в которой происходило облучение образцов, при этом пробирка находилась в термостатируемом держателе.
Интенси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.