РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), №. 1 с.
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НОВЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ АРЕНИЦИНОВ
© 2007 г. А.Д. Краснодембская
Кафедра биохимии Санкт-Петербургского Государственного Университета и лаборатория общей патологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины. РАМН
Важнейшими молекулярными компонентами системы врожденного иммунитета являются антимикробные пептиды (АМП). Изучение новых АМП важно как с фундаментальной, так и с практической точки зрения. Как антимикробные агенты АМП перспективны для разработки на их основе новых лекарственных препаратов. Ранее, при изучении антимикробных пептидов из целомоцитов кольчатого червя пескожила Arenicola marina, нами были выделены новые антимикробные пептиды — ареницины-1,2. В настоящей работе было проведено подробное изучение антимикробной и гемолитической активности ареницина-1. Определение минималъных ингибирующих концентраций (МИК) ареницина-1 в отношении целого ряда микроорганизмов (грамотрицательных, грамположительных бактерий, грибов) показало, что ареницин-1 является эффективным антибиотическим веществом с широким спектром действия. Исследуемый пептид проявлял примерно одинаковую активность против всех тестируемых микробов, его МИК во всех случаях не превышала 1 мкМ. По своей эффективности в отношении протестированных микробов, ареницин-1 сопоставим с самыми сильными пептидными антибиотиками — протегрином-1 и дефенсином кролика NP-1. Изучение влияния на антимикробную активность ареницина-1 различных факторов среды (повышенной ионной силы, изменения рН, присутствия в среде двухвалентных катионов, уровня метаболизма микробной клетки) показало, что антибактериальная активность ареници-на-1 остается стабильной в широком диапазоне условий. Ареницин-1 способен к быстрому увеличению проницаемости цитоплазматической мембраны Е. coli и, по-видимому, повреждение оболочек бактерии является ключевым в процессе гибели клетки под воздействием ареницина. Показано, что хотя ареницин-1 способен вызывать гемолиз эритроцитов человека, но гемолитическая активность начинает проявляться при высоких концентрациях пептида, намного превышающих минимальные ингибирующие концентрации, установленные в отношении микроорганизмов. Присутствие в среде сыворотки крови резко снижает гемолитическую активность ареницина, не влияя на его антимикробные свойства. Все эти качества делают ареницины перспективным объектом дальнейших прикладных исследований в области разработки новых антибиотических препаратов.
Ключевые слова: врожденный иммунитет, антимикробные пептиды животных, ареницины, минимальная ингибирующуя концентрация, механизм бактерицидного действия, гемолиз
ВВЕДЕНИЕ
В последнее время все большее значение приобретает изучение механизмов врожденного иммунитета животных. Важнейшими молекулярными компонентами системы врожденного иммунитета являются антимикробные пептиды (АМП) [1; 2]. Эти вещества являются древнейшими факторами защиты всех видов живых организмов и обнаруживаются в органах и тканях, для которых наиболее вероятен контакт с внешним патогеном (по-
фагоцитарных клеток, гемолимфа и целоми-ческая жидкость). К АМП относят группу пептидов обладающих следующими свойствами: они положительно заряжены, имеют низкую молекулярную массу (не более 10 кДа) и амфипатическую структуру (важную роль в стабилизации подобной структуры играют внутримолекулярные дисульфид-ные связи). Эти свойства лежат в основе механизма действия большинства АМП на клетки микроорганизмов, которое направлено на дестабилизацию и в конечном итоге разрушение клеточной мембраны, что вызывает серьезные системные повреждения, несовместимые с жизнедеятельностью микробной клетки. Помимо трех указанных выше общих ка-
верхностные и слизистые эпителии, гранулы
Адрес: 196135, СПб., ул. Авиационная д. 26, кв. 28. Телефон: (812) 371-38-32. E-mail: krasnodembsky@nm.ru
Ареницин-1 RWCVYAYVR V RGVLVRYRRCW 2758 Да
Ареницин-2 RWCVYAYVR I RGVLVRYRRCW 2773 Да 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021
Рис. 1. Аминокислотные последовательности аре-ницинов
честв АМП демонстрируют большое разнообразие первичных и надпервичных структур и имеют разный характер функциональной активности. Изучение новых АМП важно не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения. Как антимикробные агенты АМП весьма перспективны для разработки на их основе новых лекарственных препаратов, "антибиотиков животного происхождения". Антимикробные пептиды лишены многих недостатков свойственных традиционно применяемым антибиотикам: не вызывают формирования резистентности к ним со стороны микробов, ряд АМП способен связывать ЛПС и тем самым предотвращать эндото-ксемию и септический шок; не вызывают анафилактического шока. С другой стороны АМП представляют собой сформированные в процессе эволюции молекулярные матрицы, естественные для организмов, будучи факторами проницаемости, усиливают действие других антибиотиков, и многие обладают широким спектром антимикробной активности, включая воздействие на грибковые инфекции и штаммы бактерий, резистентные к конвенционным антибиотикам [2; 3; 4; 5; 6].
Ранее при изучении антимикробных пептидов из целомоцитов (фагоцитов) морского кольчатого червя пескожила Arenicola marina нами были выделены и охарактеризованы новые антимикробные пептиды ареницины [7]. Определение первичной структуры показало, что эти пептиды не имеют гомологии ни с одним из известных АМП и могут быть отнесены к новому структурному семейству [8]. Ареницины 1 и 2 являются изоформами, состоят из 21 аминокислотного остатка, несут общий положительный заряд +6 (за счет 6-ти остатков аргинина), содержат в своем составе 9 гидрофобных остатков, в 3-ем и 20-ом положении находятся остатки цистеина образующие внутримолекулярную дисульфидную связь. Молекула пептида, таким образом, замыкается в 18-ти членное кольцо (Рис. 1). Аре-ницины можно кратко охарактеризовать, как небольшие амфипатические циклические молекулы, несущие большой положительный заряд. Обычно такая структура является очень стабильной, устойчивой к воздействию
протеаз, и должна придавать молекуле сильные мембраноактивные свойства. Пептиды, имеющие подобный тип строения (например, протегрины [9]) характеризуются широким спектром действия, сильной эффективностью, устойчивостью к изменению условий среды, в частности к солености, а так же существенной гемолитической активностью.
В настоящей работе было проведено подробное изучение антимикробной (в частности, механизма бактерицидного действия) и гемолитической активности ареницина-1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Высокоочищенные препараты дефенсинов человека (НЫР-1,2,3), дефенсинов кролика (ЫР-1,2,3,4,5) и протегрина-1 получены в лаборатории Общей Патологии НИИЭМ путем выделения из лейкоцитарной массы [10; 11; 9], индолицидин и ареницин-1 синтезированы с использованием Вос-технологии в лаборатории химии пептидов ГосНИИОЧБ к.х.н. Колодкиным Н.И. и Афониной М.А. (заведующий лабораторией к.х.н. А.А. Колобов) Нами было проведено сравнительное тестирование природных ареницинов (1 и 2) и синтезированного аналога. Результаты сравнительного анализа физико-химических и функцио-налъных свойств пептидов (двух природных изоформ и синтетического ареницина-1) показали, что никаких различий они не имеют.
Антимикробную активность проб на разных стадиях очистки оценивали методом радиальной диффузии в агарозном геле с культурой микроорганизма [12]. В случае изучения влияния на активность пептидов различных условий среды в состав буфера для нижнего геля (в норме 10 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,4) вносились соответствующие изменения (вносили 100 — 300 мМ ЫаС1, изменяли рН буфера от 5,8 до 8, добавляли 1 мМ цитрат Ыа или 0,1% питательную среду). Для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) в отношении микроорганизмов тестировались последовательные разведения пептида в два раза от 100 мкМ до <0,1 мкМ. Точка пересечения графика линейной регрессии значений антимикробной активности с осью абсцисс принималась в качестве МИК [12].
Влияние на антимикробную активность очищенных пептидов сыворотки крови оценивалось с помощью антимикробного теста в жидкой среде в модификации Й. Андрэ и соавторов [13]. Для экспериментов с сыворот-
Наружная Цитоплазматическая
-3"С- Бета-галактозидаза О Орто-нитрофенилгалактозид
Орто-нитрофенил га Пептид
Рис. 2. Схематический рисунок, иллюстрирующий принцип метода
использованием традиционных методов вариационной статистики. Представленные данные являются усредненными значениями (среднее ± стандартное отклонение), полученными в трех независимых экспериментах, в каждом эксперименте проводили три параллельных опыта. Достоверность различий между средними двух групп оценивали с помощью 1-критерия Стьюдента на уровне значимости р<0,05. Обработку данных проводили с помощью программ Sigma Plot 4.0 и Microsoft Ехсе1 2000.
РЕЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
кой крови использовали коммерческий препарат фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FCS, Gibco, UK).
Бактерицидное действие ареницина оценивалось методом подсчета колоний по стандартной методике.
Для определения воздействия пептида на проницаемость внутренней мембраны Е.соН применяли методику Р. Лерера и соавторов [14], в качестве тест-микроба использовали специальный штамм Escherichia coli ML-35p, характеризующийся конститутивной экспрессией фермента ß-галактозидазы. В основе метода лежит модификация бета-галакто-зидазой, локализованной в цитоплазме, искусственного субстрата орто-нитрофенил-га-лактозида, продуктом этой реакции является окрашенный продукт (орто-нитрофенил). В норме доступ фермента к субстрату затруднен наружной и внутренней оболочками бактерии и данная реакция способна протекать только в том случае, если целостность обеих оболочек нарушена, и клеточное содержимое (вместе с продуктом реакции) освобождается во внешнюю среду. Ход реакции оценивали, фотометрически измеряя поглощение проб при длине волны 420 нм.
Определение гемолитической активности пептидов проводили по ст
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.