научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ IN SITU ПРОЦЕССОВ РОСТА И ДЕГРАДАЦИИ КРИСТАЛЛОВ ТЕТРАГОНАЛЬНОГО ЛИЗОЦИМА НА ПОДЛОЖКЕ КРЕМНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОРАЗРЕШАЮЩЕЙ РЕНТГЕНОВСКОЙ ДИФРАКТОМЕТРИИ Химия

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ IN SITU ПРОЦЕССОВ РОСТА И ДЕГРАДАЦИИ КРИСТАЛЛОВ ТЕТРАГОНАЛЬНОГО ЛИЗОЦИМА НА ПОДЛОЖКЕ КРЕМНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОРАЗРЕШАЮЩЕЙ РЕНТГЕНОВСКОЙ ДИФРАКТОМЕТРИИ»

КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2014, том 59, № 5, с. 749-754

ДИФРАКЦИЯ И РАССЕЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ

УДК 548.5+548.73

ИССЛЕДОВАНИЕ IN SITU ПРОЦЕССОВ РОСТА И ДЕГРАДАЦИИ КРИСТАЛЛОВ ТЕТРАГОНАЛЬНОГО ЛИЗОЦИМА НА ПОДЛОЖКЕ КРЕМНИЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОРАЗРЕШАЮЩЕЙ РЕНТГЕНОВСКОЙ ДИФРАКТОМЕТРИИ

© 2014 г. М. В. Ковальчук, П. А. Просеков, М. А. Марченкова, А. Е. Благов, Ю. А. Дьякова, Е. Ю. Терещенко, Ю. В. Писаревский, О. А. Кондратьев

Институт кристаллографии РАН, Москва E-mail: prosekov@crys.ras.ru Поступила в редакцию 27.12.2013 г.

Представлены результаты in situ-исследований роста кристаллов тетрагонального лизоцима методом высокоразрешающей рентгеновской дифрактометрии. Кристаллы выращены методом "сидячей капли" на кристаллических кремниевых подложках разного типа — как на гладких подложках, так и с искусственным рельефом на основе графоэпитаксии. Рост кристаллов осуществлялся в специальной герметичной кристаллизационной ячейке, обеспечивающей возможность получения изображений на оптическом микроскопе и проведения рентгенодифракционных in situ-исследова-ний в процессе роста кристаллов. Измерения кристаллов лизоцима проводились на различных этапах процесса кристаллизации: стадия зарождения и роста кристаллов, сформировавшиеся кристаллы, деградация кристаллической структуры и полное разрушение.

DOI: 10.7868/S0023476114050105

ВВЕДЕНИЕ

Гибридные схемы, сочетающие в себе традиционные полупроводники и высокомолекулярные органические соединения, являются одним из наиболее перспективных направлений развития молекулярной электроники.

При разработке таких схем используют различные органические материалы, причем акценты смещены на полимерные материалы, но также применяются низкомолекулярные соединения, углеродные наноматериалы, макромолекулярные биополимеры (белки, полисахариды) [1—3] и т.п. Обычно белковые кристаллы остаются за рамками таких исследований, кристаллизованный белок используется главным образом для точной расшифровки структуры белка [4], поэтому свойствам кристаллов белков уделяется существенно меньшее внимание. Для изучения возможностей использования белков в гибридных структурах нужно получить кристаллические белковые пленки и монокристаллы, исследовать их свойства и найти способ сохранять их в течение достаточно длительного времени. Весьма эффективная методика роста биологических кристаллов на кристаллической подложке на основе графоэпитаксии была предложена и реализована в [5, 6].

В настоящей публикации представлена аппа-ратурно-методическая база для изучения различных этапов кристаллизации: стадия зарождения, стадия роста, сформировавшиеся кристаллы, де-

градация кристаллической структуры и разрушение белковых кристаллов, полученная с помощью метода высокоразрешающей рентгеновской дифрактометрии in situ, позволяющего следить за изменениями дефектной структуры кристаллов. В качестве объекта использовался белок лизоцим (Hen Egg-White Lysozyme) [7, 8 и ссылки в них], кристаллизация выполнялась на кремниевой подложке.

МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТА

Кристаллизационная ячейка. Специальная ячейка (рис. 1) изготовлена из фторопласта-4 (политетрафторэтилена) размером 70 х 80 х 15 мм3. Она состоит из двух основных частей: корпуса и чаши, фиксированной на основании. Нижняя часть корпуса позволяет крепить ячейку на гониометр рентгеновского дифрактометра в горизонтальной геометрии, когда плоскость дифракции располагается вертикально (в частности, на синхротронной станции). Конструкция ячейки позволяет реализовать различные экспериментальные схемы: дифракцию в скользящей геометрии, сильно асимметричную дифракцию (диапазон 29 до 180°); схемы в геометрии полного внешнего отражения (в области малых углов, порядка нескольких критических ac); in-plane и out-of-plane геометрии (диапазон по 29/х до 35°). Используемые материалы и конструкция ячейки

Рис. 1. Специальная герметичная кристаллизационная ячейка для получения белковых кристаллов на кристаллической подложке с рентгенопрозрачным окном.

рассчитаны на обеспечение химической чистоты внутреннего объема ячейки и ее герметичности в течение, примерно, четырех недель. Верхняя часть внутреннего объема представляет собой окно из материала прозрачного для света и слабопо-глощающего в рентгеновском диапазоне.

Выращивание кристаллов. Кристаллизацию белка проводили из газовой фазы методом "сидячей капли" [8], который заключается в том, что концентрированный раствор белка помещают на подложку и размещают в замкнутом пространстве (ячейке), где с помощью осадителя обеспечивается специальная среда. Использовались подложки из монокристаллов кремния (Si) как с графоэпи-таксиальной структурой, так и с гладкой поверхностью. Подложки размещались в центральной зоне пьедестала кристаллизационной ячейки, возвышающегося над резервуаром с осадителем.

Из ранних работ известно [5, 6, 9 и ссылки в них], что зарождающиеся кристаллиты белка взаимодействуют со ступенями графоэпитаксиаль-ной структуры и осаждаются на них ориентированным образом. Рост биокристаллов реализуется присоединением монокристаллических блоков биологических макромолекул к торцам микро-или макроступеней, созданных на поверхности кристаллизационной подложки.

Для кристаллизации белка использовался ли-зоцим фирмы Sigma, 0.1 M раствор натрий-ацетатного буфера с показателем pH = 4.55, в качестве осадителя — хлорид натрия. Концентрация осадителя в буферном растворе составляла 25 мг/мл. Концентрация белка — 40 мг/мл. На подложки Si, расположенные на пьедестале, при помощи микропипеток раскапывали раствор белка в буфере, а затем раствор осадителя по 3 мкл соответственно. Также раствор осадителя (500 мкл) раскапывали по краю пьедестала с подложками и в специальном резервуаре. Температура в поме-

щении, в котором проводился процесс кристаллизации, поддерживалась постоянной и составляла 19°С.

Кристаллы образовывались за 48—96 ч, и достигали максимальных размеров через ~7—9 сут (~190 ч) после начала кристаллизации. Линейные размеры кристаллов составляли от 350 до 800 мкм, высота кристаллов составляла в среднем 300 мкм (от 150 до 450 мкм).

Первоначально ячейка с каплями растворов белка и осадителя помещалась в оптический микроскоп для мониторинга процесса зарождения и начального этапа кристаллизации лизоцима. На указанных стадиях кристаллизации фиксировались размеры, грани кристаллов, их количество в каждой капле и т.д. В дальнейшем микроскопические изображения кристаллов получали перед каждой серией рентгенодифракционных измерений.

Реализация рентгенодифракционных экспериментов. На стадии формирования кристаллов, начиная с размеров ~200—300 мкм, кристаллизационная ячейка устанавливалась на гониометр рентгеновского дифрактометра и проводилась серия рентгенодифракционных in ¿йи-эксперимен-тов. Измерения проводились на протяжении всего "цикла жизни" кристаллов, вплоть до деградации и разрушения кристаллической структуры.

Рентгенодифракционные эксперименты выполнялись на дифрактометре SmartLab Rigaku [10] в стандартной схеме высокоразрешающей двух-кристальной дифрактометрии в геометрии на отражение. Дифрактометр оснащен источником излучения с вращающимся молибденовым анодом мощностью 9 кВт. Интенсивность дифрагированного пучка регистрировалась сцинтилляционным (NaI) детектором. Пучок формировался с использованием симметричного двукратного монохро-матора Ge (220), после чего устанавливались щели, ограничивающие падающий пучок в плоскости дифракции (0.03—1.00 мм) и поперечном направлении (5.0, 2.0 или 0.5 мм). Это позволяло использовать спектральную линию Мо^а1 (X = = 0.70932 Á), а также варьировать пространственное разрешение (локальность) измерений при проведении экспериментов. При этом имелась возможность регулировки двух приемных щелей, расположенных перед детектором на расстоянии 113.0 мм друг от друга, в диапазоне 0.03—20.00 мм.

Также дифрактометр оснащен специальной ^Т-подвижкой (диапазон перемещения охватывает всю подложку), что позволило установить исследуемый образец относительно пучка в требуемом положении с точностью 0.01 мм. Указанные размеры щелей и весьма точное ^Т-позицио-нирование подложки относительно пучка позволяют сформировать пятно засветки ~0.1 х 0.5 мм2 и локализовать отдельные кристаллы для рентгенодифракционных in siíu-исследований.

ИССЛЕДОВАНИЕ IN SITU ПРОЦЕССОВ РОСТА И ДЕГРАДАЦИИ КРИСТАЛЛОВ

751

I/Io

9-29, град

Рис. 2. Экспериментальные рентгеновские зависимости 9-29-сканирования (1-4) на начальной стадии формирования кристаллов тетрагонального лизоцима (а). Схематично показаны расположение на подложке 81 капель, в которых происходит кристаллизация белка (к1 и к3), "реперной" капли осадителя без белка (к2), и положения рентгеновского пучка при проведении измерений (1—Ш) (б). Изображения, полученные на оптическом микроскопе на стадии зарождения (в) и начальной стадии роста (г) кристаллов: 1 — "реперная" капля (к2) осадителя без белка, положение III; 2 — рассеяние от подложки 81, положение пучка II; 3, 4 — капля с кристаллами, положение I, на стадии зарождения (3), через 96 ч после загрузки ячейки, и на начальной стадии роста (4), через 122 ч после загрузки ячейки. На вставке — дифракционный пик на стадии зарождения кристаллов. Наблюдается расщепление пика и уширение дифракционной кривой.

После установки ячейки на гониометре измерения проводились по следующей схеме. Рентгеновский пучок на образце позиционировался так, чтобы отражение осуществлялось от подложки 81, не захватывая капли с белком (к1) или осадителем (к2). Это отмечено индексом II на рис. 2б. В этом положении проводилась стандартная юстировка ориентации кристаллической подложки для проведения измерений методом высокоразрешающей двухкристальной дифрактометрии [11].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Начальная стадия формирования кристаллов. Первые измерения были проведены через 96 ч после загрузки кристаллизационной ячейки (помещения на подложку из кремния раствора белка и осадителя и герметизации ячейки). Средний размер кристаллов составлял ~200—300 мкм.

Проводилась серия 9-29-сканирований в диапазоне углов 29 от 1° до 6° в трех положениях обла

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»