ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ [АТФ] В ЦИТОЗОЛЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ ПРИ РАЗВИТИИ ГЛУТАМАТ-ИНДУЦИРОВАННОЙ ДИЗРЕГУЛЯЦИИ КАЛЬЦИЕВОГО ГОМЕОСТАЗА

ГОРБАЧЕВА Л.Р.; ПИНЕЛИС В.Г.; САВИНКОВА И.Г.; СУРИН А.М.; ХОДОРОВ Б.И.; ШАРИПОВ Р.Р.

БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 2, с. 196 - 208

УДК 577.352.4

ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ [АТФ] В ЦИТОЗОЛЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ ПРИ РАЗВИТИИ ГЛУТАМАТ-ИНДУЦИРОВАННОЙ ДИЗРЕГУЛЯЦИИ КАЛЬЦИЕВОГО ГОМЕОСТАЗА

1 НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, ул. Балтийская, 8, 125315Москва; факс: +7(495)151-1726, электронная почта: surin_am@yahoo.com

2 Научный центр здоровья детей РАМН, Ломоносовский просп., 2/1,

119991 Москва

3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,

119991 Москва

Поступила в редакцию 30.08.13 После доработки 28.10.13

Впервые проведен одновременный мониторинг изменений концентрации АТФ в цитозоле ([ATP]c), внутриклеточной концентрации свободного Са2+ ([Ca2+]j) и рН в цитозоле (рНс) в индивидуальных культивируемых нейронах при токсических воздействиях глутамата (Glu). Для этого в нейронах из гиппокампа 1-2-дневных крыс экспрессировали АТФ-сенсор АТ1.03, связывание которого с АТФ увеличивает эффективность резонансного переноса энергии (FRET) между синим флуоресцентным белком (донором энергии) и желто-зеленым флуоресцентным белком (акцептором энергии). Возбуждение флуоресценции белка-акцептора позволило отслеживать изменения цитозольного рН (рНс). Для регистрации [Ca2+]j клетки нагружали низкоаффинными флуоресцентными Са2+ индикаторами Fura-FF или X-rhod-FF. Показано, что Glu (20 мкМ, 10 мкМ глицина, 0 Mg2+) вызывает быстрое закисление цитозоля и снижение [АТР]с. Между скоростью снижения [АТР]с и латентным периодом развития индуцированной глутаматом отсроченной кальциевой дизрегуля-ции (ОКД) существует примерно линейная зависимость (r2 = 0,56), при которой большей скорости падения [АТР]с соответствует более короткий латентный период ОКД. ОКД начиналась при снижении [АТР]с до ~16%. В фазе высокого [Ca2+] плато [АТР]с опускалась до ~10% относительно уровня в покоящихся нейронах (100%). При действии глутамата в присутствии оубаина (0,5мМ) снижение [АТР]с в фазе высокого [Ca2+] плато составило лишь ~37%. Данные об изменениях [АТР]с, [Ca2+]j, и рНс в бескальциевом или безнатриевом буферах, а также в присутствии ингибитора №+/К+-АТФазы оубаина (0,5 мМ) позволили предположить, что одним из пусковых факторов ОКД, помимо увеличения протонной проводимости и падения [АТР]с, является реверсия №+/Са2+-обмена плазматической мембраны нейронов.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: нейроны, глутамат, кальциевая дизрегуляция, АТФ, митохондрии.

При травмах и инсульте в мозге вокруг зон повреждения возникают области, в которых основной возбуждающий нейротрансмиттер центральной нервной системы (ЦНС) глутамат (Glu) может длительно удерживаться в межклеточном пространстве при высоких концентрациях, приводя к избыточной стимуляции глутаматных рецепторов и развитию отсроченной гибели нейронов [1, 2]. На первичных нейрональных культурах, которые часто используют для моделирования патологических состояний ЦНС, показа-

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

но, что длительное воздействие Glu вызывает сначала быстрый подъем внутриклеточной концентрации свободного Са2+ ([Ca2+]j), который стабилизируется на уровне 1—3 мкМ [3]. После лаг-периода продолжительностью от единиц до десятков минут в нейронах развивается вторичный подъем [Ca2+]j, амплитуда которого может достигать десятков микромолей/литр [4]. Этот вторичный подъем [Ca2+] получил название «отсроченная кальциевая перегрузка» [5], позже закрепившийся под термином «отсроченная кальциевая дизрегуляция» (ОКД, [6]). ОКД возникает синхронно с сильной митохондриальной

деполяризацией [6—8] в тот момент, когда скорость удаления Са2+ из цитозоля начинает уступать скорости его поступления.

При достижении [Ca2+]j уровня единиц мкмо-лей/литр №+/Са2+-обменники плазматической мембраны подключаются к удалению Са2+ из цитозоля, помогая Са2+ насосам плазмалеммы удерживать [Ca2+]j на относительно низком уровне [9, 10]. Выведение избытка Са2+ из цитозоля, т.е. работа №+/Са2+ обмена в «прямом» режиме (в режиме «прямой моды»), осуществляется благодаря градиенту концентрации Na+ и наличию трансмембранного потенциала плазма-леммы, поскольку №+/Са2+-обменники являются электрогенными и, в зависимости от подтипа, переносят 3 Na+ в обмен на 1 Са2+, или 4 Na+ в обмен на 1 Са2+ и 1 К+ [9]. Трансмембранный градиент Na+ и потенциал плазматической мембраны (Л¥р) поддерживают №+/К+-АТФазы плазматической мембраны, которые в совокупности с Са2+-АТФазами потребляют в мозге почти половину всего АТФ [11].

Известно, что одновременно с входом Са2+ в цитозоль происходит вход Na+ по Glu-управля-емым ионотропным рецепторам преимущественно NMDA-типа [12]. Поскольку концентрация Na+ в буфере почти на два порядка выше концентрации Са2+, активация NMDA-каналов вызывает массивный вход в цитозоль Na+ [13—16] и подъем его концентрации до 30—60 мМ [4, 15] в гиппокампальных нейронах и ~70 мМ в гранулярных нейронах мозжечка [14]. Поступление Na+ снижает как трансмембранный градиент концентрации Na+ [13—16], так и Л¥р [14], что приводит к реверсии №+/Са2+-обмена и превращению его из механизма защиты нейронов от Са2+ перегрузки в дополнительный путь поступления Са2+ в цитозоль. В этих условиях вся нагрузка по удалению избытка Са2+ из цитозоля ложится на митохондрии и Са2+-насосы плазмалеммы.

Работу Na+/K+- и Са2+-АТФаз обеспечивает АТФ, образующийся в результате гликолиза в цитозоле и окислительного фосфорилирования (ОксФос) в митохондриях. Недавно на основании измерений [Ca2+]b митохондриального потенциала (Л¥т) и NAD(P)H автофлуоресценции культивируемых нейронов, подвергнутых токсическому действию Glu, высказана гипотеза о том, что основным фактором, диктующим развитие ОКД, является гиперактивация PARP-1, ведущая к исчерпанию NAD+ и, как следствие, прекращению митохондриального синтеза АТФ [17, 18]. Однако измерений концентрации АТФ в цитозоле ([ATPfc) тех же самых нейронов, в которых развилась ОКД, насколько нам известно, до сих пор не было выполнено. Измерения

[ATP] в среднем по клеточной популяции, выполненные с применением физико-химических или биохимических методов анализа показали, что токсические воздействия Glu снижают [ATP] в нейрональных культурах на 40—60% [19—23]. Подобные изменения едва ли можно квалифицировать, как исчерпание АТФ или «энергетический кризис».

В настоящей работе для решения вопроса, предшествует ли энергетический коллапс развитию ОКД, были измерены Glu-индуцированные изменения [ATPfc в индивидуальных нейронах, экспрессирующих в цитозоле флуоресцентный АТФ-сенсор АТ1.03 [24]. Изменения [ATPK вызванные нейротоксическими дозами Glu, сопоставили с изменениями [Ca2+]j и рН цитозоля (рНс) в условиях одновременного и раздельного поступления Na+ и Са2+ по Glu-управляемым ионным каналам, а также при блокаде №+/К+-на-соса плазмалеммы оубаином. Показано, что в культивируемых гиппокампальных нейронах, экспрессирующих АТФ-сенсор, ОКД наступала тем раньше, чем больше скорость падения [ATPfc, и в среднем начиналась при снижении [ATPfc до ~20% от ее уровня в покоящихся нейронах. Исследования также показали, что для развития ОКД падение [ATPfc не является достаточным условием и требуются другие факторы, такие, как, например, реверсия №+/Са2+-обмена.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Приготовление первичных нейрональных культур. Приготовление культур из гиппокампа 1-2-дневных крыс Вистар, экспрессию в цитозоле клеток флуоресцентного белкового АТФ-сенсора АТ1.03 и измерения [АТР]с производили как описано в [25] с небольшими изменениями. Эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным. Животных анестезировали, декапитировали, извлекали мозг и затем гиппокампы. Суспензию клеток (106 клеток/мл) получали, обрабатывая гиппокампы папаином (10 ед/мл), диссоциируя 15-кратным пипептированием, и отмывали от разрушенных клеток двукратным осаждением в центрифуге (1000 об/мин). Суспензию (200 мкл) переносили на покровные стекла, прикрепленные к лункам 35 мм пластиковых чашек Петри («MatTek», США). Стекла предварительно покрывали полиэтиленимином (10 мг/мл). Через час добавляли 1,5 мл нейробазальной среды, содержащей 2%-ный Supplement B-27 и 0,5 мМ

L-глутамина. Клетки содержали при 37° в атмосфере 5%-ной СО2/95%-ного воздуха при 100%-ной влажности. На 3—4 день добавляли арабинозид (AraC, 10 мкМ) для подавления роста глиальных клеток. Культуры использовали на 8—13 день после посадки (2—7 дней после трансфекции).

Флуоресцентно-микроскопические измерения. Для одновременного измерения [ATP]c и рНс мы воспользовались тем, что в АТ1.03 использован феномен флуоресцентного (ферстеровско-го) резонансного переноса энергии (FRET). При регистрации сигнала АТ1.03 в условиях возбуждения флуоресценции только белка-акцептора энергии (возбуждение 485 нм, испускание 525 нм) практически исключена зависимость флуоресценции от уровня [ATP]c, что позволило отслеживать изменения только рНс. Относительные изменения [ATP]c представляли в виде отношения интенсивностей флуоресценции (F440/F485), измеряемых при возбуждении акцептора поочередно в максимуме полосы поглощения донора (440 нм) и вблизи максимума полосы поглощения акцептора (485 нм) (регистрация сигнала при 525 нм). Такой способ регистрации по объему получаемой информации об изменениях [ATP]c эквивалентен более традиционному способу, примененному авторами белкового конструкта АТ1.03 [24], однако обладает рядом преимуществ: i) позволяя использовать АТФ-сенсор для отслеживания одновременно [ATP] и рН в одной и той же области клетки; 2) обходиться обычным дихроичным зеркалом для флуоресцеина (порог отражения ~500 нм) вместо зеркала с порогом ~460 нм и 3) не требует устройства смены светофильтров (фильтрового колеса) перед CCD-камерой (либо установки двух камер).

Измерения выполнены на установке, включающей инвертированный микроскоп Olympus IX-71, систему освещения Sutter Labmda 10-2 со 175 Вт ксеноновой лампой («Sutter Instruments») и CCD-каме

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.