ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 93, № 3, с. 489-496
УДК 594.1:591.48
ИССЛЕДОВАНИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ПЕДИВЕЛИГЕРА ДВУСТВОРЧАТОГО МОЛЛЮСКА MYA ARENARIA
© 2014 г. Л. П. Флячинская1 , О. И. Райкова1, 2
1Зоологический институт РАН, Санкт-Петербург 199034, Россия e-mail: l.flyach@gmail.com 2Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург 199034, Россия
Поступила в редакцию 20.09.2013 г.
Впервые методом иммуноцитохимии при двойном флюоресцентном окрашивании антителами к серотонину и FMRF-амиду исследовано строение нервной системы педивелигера двустворчатого моллюска Mya arenaria. Серотонин выявляется в нервных клетках апикального органа. Эти клетки соединяются многочисленными нервными отростками с клетками, расположенными по краю нервного кольца, которое охватывает парус и глотку. Кроме того, серотонин обнаружен в парных цереброплевральных и висцеропариетальных ганглиях и в формирующемся циркумпаллиальном нерве. FMRF-амид, ко-локализованный с серотонином, обнаружен в нервных клетках апикального органа, висцеропариетальном ганглии и цереброплевральном ганглиях. Только FMRF-амид выявлен в комиссурах, идущих от апикального органа к педальным ганглиям, педальных коннективах, клетках педального ганглия и педовисцеральных комиссурах. По нашему мнению, нервные клетки апикального органа не имеют преемственности с церебральным ганглием взрослого моллюска, поскольку цереброплевральный ганглий закладывается отдельно на стадии педивелигера.
Ключевые слова: моллюски, личинки, нервная система, иммуногистохимия, прижизненные наблюдения.
DOI: 10.7868/S0044513414030064
Среди морских беспозвоночных животных двустворчатые моллюски издавна служат объектом изучения личиночного развития. Организации нервной системы двустворчатых моллюсков, особенно их личинок, посвящено определенное количество исследований. Большинство работ относится к изучению представителей рода Myti-lus (Kulakovskiy, Flyachinskaya, 1994; Raineri, Ospo-vat, 1994; Raineri, 1995; Flyachinskaya, 2000; Voron-ezhskaya et al., 2008). Несколько меньше исследованы другие представители Bivalvia (Croll et al., 1997; Kreiling et al., 2001). Моллюскам рода Mya как важному компоненту литоральных и сублиторальных сообществ посвящена достаточно обширная литература. Однако работ, относящихся к личиночному развитию и, тем более, развитию нервной системы практически нет. Mya arenaria (Linnaeus 1767) — широко распространенный бо-реально-арктический двустворчатый моллюск. В Белом море встречается практически повсеместно, населяя сублиторальную зону (Наумов, 2006).
Задачей данной работы стало подробное изучение строения нервной системы поздней личиночной стадии Mya arenaria — педивелигера. Пе-дивелигер Mya arenaria представляет собой личинку трохофорного типа, заключенную в
двустворчатую раковину (Иванова-Казас, 1977). В исследовании нервной системы педивелигера была использована двойная реакция на серотонин и FMRF-амид, поскольку ранее было показано, что именно эта комбинация антител адекватно маркирует нейрональные элементы в личиночном развитии трохофорных (Сго11, 2000).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.
Сбор материала. Исследования проводили на базе Беломорской биологической станции ЗИН РАН в губе Чупа Кандалакшского залива Белого моря. Планктонные пробы брали в августе при помощи планктонной сети с размером ячеи 60 мкм. Для исследований из планктона отбирали нормально развивающихся активных личинок, находящихся на стадии педивелигера.
Иммуногистохимическое выявление серотонина и FMRF-амида. Личинок фиксировали в жидкости Стефанини (2%-ный параформальдегид и 15%-ная пикриновая кислота на 0.1 М №-фос-фатном буфере рН = 7.4) в течение 1.5—2 суток при температуре 4°С. Далее следовала отмывка в течение 24 ч в 0.1 М фосфатном буфере с добавлением 20%-ной сахарозы. Иммуногистохимиче-
Рис. 1. Схема строения педивелигера Муа агвпап, основанная на прижизненных наблюдениях. АО — апикальный орган, АС — апикальный султанчик, Ан — анальное отверстие, БЖ — биссусная железа, Ж — желудок, ЖА — жаберный аппарат, ЗА — задний аддуктор, К — кишечник, М — мышцы, МРП — мышцы — ретракторы паруса, Н — нога, НКА — нервные клетки апикального органа, НКП — нервные клетки паруса, НКР — нервные клетки ротовых лопастей, П — парус, ПА — передний аддуктор, Пв — пищевод, Пч— печень, Р — раковина, РЛ — ротовые лопасти, РО — ротовое отверстие.
Пч
Ан
ская реакция проводилась на тотальных препаратах личинок, приклеенных к предметным стеклам поли-L-лизином (poly-L-lysine, SERVA). Перед проведением реакции уже приклеенных к стеклу животных промывали в 0.0l M PBS (phospate-buffer saline, SIGMA), затем выдерживали в l% BSA (bovine serum albumin, SIGMA) c добавлением 0.2%-ного детергента тритона X-l00, для повышения проницаемости клеточных стенок.
При двойном флуоресцентном окрашивании животных инкубировали в коктейле первичных антител: кроличьего анти-FMRF-амида (IMMUNOSTAR) и козьего анти-SHT (IMMUNOSTAR) в разведении l : 400 в PBS-T в течение 72 ч при температуре l0°C. После промывки 3 раза по S мин в PBS животных сначала инкубировали в течение одного часа при температуре 20°C с вторичным FITC-коньюгированным антителом (swine anti-rabbit, DAKO), а затем при тех же условиях с — TRITC-коньюгированным антителом (swine- anti-
goat, DAKO). Оба вторичных антитела были разведены в отношении 1 : 40 в PBS-T.
После окончательной промывки в PBS 3 раза по 5 мин препараты заключали в PBS-глицерин (7 : 3), а края препаратов герметизировали лаком для ногтей. Контроль на специфичность включал: 1) инкубацию животных без первичного антитела, 2) использование неиммунной сыворотки (IMMUNOSTAR). Получившиеся тотальные препараты рассматривали в конфокальном микроскопе Leica TCS SP 5. Серии оптических срезов использовались для получения проекций максимальной интенсивности и трехмерных реконструкций.
Прижизненные наблюдения. Перед проведением гистохимической реакции проводились прижизненное изучение и фотографирование каждой личинки для последующего сопоставления с результатами, полученными на этой же особи гистохимическими методами. Для фотосъемки личинок
Рис. 2. Элементы нервной системы паруса и ротовых лопастей педивелигера, реконструкция на основе послойной прижизненной микрофотосъемки: а — апикальный орган с примыкающими нервными клетками, при выпущенном личинкой парусе; б — нервное кольцо вокруг паруса и глотки, при втянутом личинкой парусе. АО — апикальный орган, АС — апикальный султанчик, НКА — нервные клетки апикального органа, НКП — нервные клетки паруса, НКР — нервные клетки ротовых лопастей. Масштаб 25 мкм.
использовали микроскоп МББ-1 (40х, окуляр 10х, суммарное увеличение 400х) и устройство визуализации на базе цифровой камеры CANON. Съемку проводили с фиксированным сдвигом фокуса по направлению снизу вверх. Для каждого объекта получали, таким образом, серию микрофотографий, которые становились материалом для последующей компьютерной реконструкции (Fly-achinskaya, Lesin, 2006). Промеры личинок и их отдельных органов проводили уже по микрофотографиям в программе Image Tool.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На ранних этапах развития, подобно другим моллюскам с пелагической личинкой, My a arenaria последовательно проходит стадии дробления, конхостомы, трохофоры, велигера и педивелигера.
Стадии педивелигера личинка Mya arenaria достигает при размере 210—220 мкм на 15-17-е сутки планктонной жизни. Метаморфоз при средней температуре 10—12°С происходит через 30—35 суток после оплодотворения, после достижения личинкой размера 300—310 мкм.
Педивелигеры Mya arenaria очень подвижны. Основным локомоторным органом является парус (П) или веллюм, окруженный венчиком длинных ресничек (рис. 1). Длина этих ресничек может достигать 50—80 мкм в зависимости от разме-
ра самого педивелигера. Венчик паруса окружает апикальный султанчик (АС) и расположенный в его основании апикальный орган (АО) (рис. 1, 2а). При помощи ресничек паруса педивелигер совершает поступательные движения, вращаясь при этом вокруг своей оси. Даже легкое прикосновение апикального султанчика к какому-либо предмету или какой-либо другой раздражающий фактор вызывает немедленное втягивание паруса и замыкание створок раковины (Р). Подобное движение происходит при участии мышц-ретракто-ров паруса (МРП) и переднего (ПА) и заднего (ЗА) аддукторов (рис.1).
Нога после достаточного развития также становится локомоторным органом. С ее помощью личинка передвигается по субстрату. Нога покрыта многочисленными мелкими ресничками, размер которых 1.5—3.0 мкм. В основании ноги расположен орган равновесия — статоцист (СтЦ) (рис. 1).
Под раковиной тело личинки окружено мантией. В комплекс мантийных органов личинки входят парус (П), нога (Н), ротовое отверстие (РО), окруженное ротовыми лопастями (РО), и жаберный аппарат (ЖА) (рис. 1).
Личинка активно питается. Пищеварительная система педивелигера асимметрична. Основная масса печени (Пч) смещена вправо (по направлению движения), и между ней и желудком (Ж), с левой стороны, имеется вырост, в который впада-
Рис. 3. Иммунная реакция против серотонина при двойном флюоресцентном окрашивании личинки Mya arenaria на стадии педивелигера: а — общая картина, б — нервный плекус мантии и клетки паруса. ВпГ — висцеропариетальный ганглий, Ж — желудок, ЗМН — задний мантийный нерв, НКА — нервные клетки апикального органа, НКП — нервные клетки паруса, НКР — нервные клетки ротовых лопастей, НО — нервные отростки, НПМ — нервный плексус мантии, ПГ — педальный ганглий, ПГК — парусно-глоточное кольцо, ПМН — передний мантийный нерв, Стц — статоцист, ЦпГ — цереброплевральный ганглий, ЦпН — циркумпаллиальный нерв. Масштаб 100 мкм.
ет пищевод (Пв). Кишечник (К) отходит от желудка справа. Стенки пищевода и передней кишки личинки на стадии педивелигера снабжены как крупными, так и более мелкими ресничками. Мелкие реснички создают, видимо, постоянный ток жидкости, а крупные активно двигаются только в момент захвата пищи. Стенки желудка также снабжены мелкими ресничками (рис. 1).
Визуальные наблюдения за личинками на данной стадии развития показывают, что при питании п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.