НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 3, с. 248-256
КЛИНИЧЕСКАЯ НЕЙРОХИМИЯ
УДК 616.832.522-07:616.74-008.939.6-091.8
ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОГЕНЕЗА МЕДЛЕННЫХ НЕЙРОИНФЕКЦИЙ
ПРОТЕОМНЫМИ ТЕХНОЛОГИЯМИ
© 2007 г. Л. И. Ковалев1*, М. А. Ковалева1, М. В. Буракова1, Л. С. Еремина1, С. С. Шишкин1, С. В. Шигеев4, М. В. Серебрякова3, М. Н. Захарова2, И. А. Завалишин2
1 Институт биохимии им. АН. Баха РАН, Москва 2 ГУ Научный центр неврологии РАМН, Москва 3 ГУ НИИ Научно-исследовательский институт физико-химической медицины, Москва 4 ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов, Москва
Этиология и патогенез бокового амиотрофического склероза (БАС) все еще неясны. Среди нескольких гипотез рассматриваются и аутоиммунные механизмы. Мы представили в настоящей работе данные о выявлении аутоантител против белков двигательной коры и скелетной мускулатуры в сыворотке пациентов с БАС. В двигательной коре в основном обнаруживались аутоантитела против карбонилредуктазы 1, а енолазы, 2',3'-фосфодиестеразы циклических нуклеотидов, пируватки-назы 3 (изоформы 2), а в скелетной мышце - против мышечной креатинфосфокиназы, миоглобина, карбоангидразы III, тропонина I быстрого типа у большинства пациентов с БАС. Также в ткани скелетной мышцы выявлены динамические изменения в структуре тропонинового комплекса. Значимость присутствия в сыворотке больных БАС аутоантител к белкам двигательной коры неясна. Возможно, что они появляются как вторичный иммунологический эффект поражения нейронов. Можно предположить также, что они ускоряют поражение мышечной ткани и двигательных мотонейронов.
Ключевые слова: протемные технологии, боковой амиотрофический склероз, аутоантитела, тропонин.
Принятые сокращения: БАС - боковой амиотрофический склероз, 2DE - двумерные электрофоре-граммы.
Боковой амиотрофический склероз (БАС), характеризующийся сочетанием прогрессирующего поражения периферических и центральных двигательных мотонейронов, а также мышечными атрофиями, встречается в разных странах мира примерно с равной частотой, которая достигает 0.2-0.7% всех заболеваний нервной системы [1, 2]. Подавляющее большинство БАС составляют спорадические случаи, тогда как на семейные случаи приходится не более 10% [1, 3-5], при этом в каталог Мак-Кьюсика (ОМШ, www.nc-bi.nlm.nih.gov) уже включено 8 менделирующих видов БАС, в числе которых как аутосомно-до-минантные, так и аутосомно-рецессивные формы, гены которых локализованы на хромосомах 21, 22, 2, 15, 9 и др.
К настоящему времени убедительно показано, что до 20% случаев семейного БАС (БАС-1) и некоторые спорадические случаи ассоциированы с мутациями в гене супероксиддисмутазы 1 ^ОБ1), который располагается на хромосоме 21 [2, 3, 5, 6]. В некоторых работах также отмечалась ассо-
* Адресат для корреспонденции: 119071 Москва, Ленинский просп., д. 33; e-mail: kovalyov@inbi.ras.ru
циация БАС-1 с делециями или инсерциями в гене NEFH, картированном на хромосоме 22 и кодирующим тяжелую субъединицу нейрофиламентно-го белка [7, 8]. БАС-2 связывают с мутациями в гене альсина (ALS2), который локализован на хромосоме 2 [9]. Работы по идентификации других белков и генов, ответственных за возникновение иных форм БАС, продолжаются [10].
На фоне успехов в анализе генов, ответственных за БАС, молекулярные механизмы патогенеза этого заболевания остаются мало изученными [6, 11]. При этом генетический компонент составляет лишь небольшую долю вклада в развитие данного вида патологии; вероятно, неблагоприятным является именно специфическое сочетание аллельных вариантов продуктов ряда генов в сочетании с инфекционным воздействием. Однако в отдельных работах показано, что в крови больных повышается уровень креатинфосфокиназы [12], что, возможно, является следствием нарушения нейрорегуляции. При этом появляются аутоантитела, способные повреждать нейрон-подобные клетки в культуре [13, 14].
В последние годы в исследованиях БАС и других видов патологии нервно-мышечной системы начинают активно применять протеомный подход, в котором используется двумерный электрофорез по О'Фарреллу (2Д-ЭФ) в сочетании с целым комплексом других технологий [11, 15-17]. Ранее с помощью 2Д-ЭФ мы описали количественные и качественные изменения (по сравнению с нормой) отдельных мышечных белков, которые исследовали в биоптатах, полученных из скелетных мышц лиц с БАС [18]. В настоящей работе представлены расширенные данные об изменениях в скелетных мышцах больных с БАС белков тропонинового комплекса и о возможном участии аутоиммунного компонента в патогенезе медленных нейроинфекций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Под наблюдением было 26 пациентов с БАС и 3 - с рассеянным склерозом. Диагноз был поставлен в соответствии с диагностическими критериями Всемирной Федерации неврологов [19]. Пациенты включались в исследование в том случае, если они давали на это письменное или засвидетельствованное информированное согласие. Биопсии мышечной ткани были получены от 11 больных при хирургических манипуляциях из m. gastrocnemius dextra (n = 8), m. gastrocnemius sinistra (n = 2) и m. triceps sinistra (n = 1). У 3-х больных выявлялась начальная стадия (при продолжительности симптоматики от 6 мес. до 1 года), у 8 - генерализованная. В качестве контроля использовались биопсийные (полученные при хирургических операциях) и аутопсийные образцы (n = 45) скелетных мышц от лиц, не имевших признаков БАС. Кроме того, параллельно были проанализированы биопсийные материалы от ряда пациентов с другими нервно-мышечными заболеваниями, в числе которых митохондриальные миопатии (n = 10) и болезнь экспансии тринуклео-тидных повторов (n = 6), которые любезно предоставила к.б.н. Е.Ю. Захарова (Медико-генетический научный центр РАМН) и к.м.н. В.В. Поли-щук (НИИ неврологии РАМН).
Приготовление белковых экстрактов, проведение их фракционирования методом 2Д-ЭФ в собственных модификациях (вариант I - с использованием изоэлектрического фокусирования в сформированном градиенте рН; вариант II - c использованием неравновесного электрофореза в градиенте рН) и анализ полученных электрофо-реграмм выполняли, как описано ранее [20, 21]. Для визуализации белков использовали окрашивание гелей сначала Кумасси голубым R-250 [22], затем азотнокислым серебром [23], а в экспериментах по выявлению аутоантигенов перед электропереносом на нитроцеллюлозные мембраны гели проявляли в 4 М ацетате калия. Денситомет-
рию отдельных фрагментов двумерных электро-фореграмм проводили, используя программу Melanie 3.
Для выявления аутоантител использовали "сэндвич" модификацию иммуноблоттинга [21].
Аутоптаты скелетной мышцы и двигательной коры головного мозга здоровых доноров фракционировали 2Д-ЭФ и переносили с полиакрила-мидных гелей электроблоттингом на нитроцеллюлозные мембраны, которые обрабатывали препаратами сывороток крови в качестве "первых антител" от больных БАС (n = 15), рассеянным склерозом (n = 3) и здоровых доноров (n = 3) в разведении 1:30, а затем пероксидазным конью-гатом кроличьих антител в качестве "вторых антител" против суммарных иммуноглобулинов человека ("ИМТЕК", Россия). Для регистрации результатов фильтры проявляли в 2.2 мМ растворе 4-хлор-1-нафтола.
Обработку гелей, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов для идентификации белков с помощью масс-спектрометрии проводили согласно протоколам [24] с некоторыми модификациями [25]. Образец (0.5 мкл) смешивали на мишени с таким же объемом раствора 20%-ного ацето-нитрила, содержащего 0.1% трифторуксусной кислоты и 20 мг / мл 2.5-дигидроксибензойной кислоты ("Sigma", США) и высушивали на воздухе. Масс-спектры получали на MALDI-TOF-масс-спектрометре Reflex ill ("Bruker", США) с УФ-ла-зером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да и калибровали их, используя известные внутренние стандарты. Идентификацию белков проводили с помощью программы Mascot, опция Peptide Fingerprint ("Matrix Science", США), с точностью определения массы МН+ равной 0.01% (допуская возможность модификации цистеинов акриламидом и окисления метионинов), по базам данных Национального центра биотехнологической информации США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Клиническая картина БАС проходит этапы мышечных гипотрофий, которые у лиц в генерализованной стадии достигают состояния атро-фий. Соответственно, для изучения молекулярных механизмов патогенеза этого заболевания представлялось перспективным проведение системных исследований мышечных белков у пациентов, находящихся на ранней и генерализованной стадиях течения болезни. Первичные данные исследования мышечных тканей больных позволили выявить ряд изменений в спектре белков мышечной ткани [18]. В настоящей работе представлены данные по идентификации изменяющихся качественно или количественно белков,
Таблица 1. Белки скелетной мышцы, проявляющие изменения у больных БАС, идентифицированные с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии
№ Наименование белка № согласно GeneBank gi: Процент совпадения масс выявленных триптических пептидов с последовательностью белка Мол. масса/pI эксп. Мол. масса/pI теор.
1 Медленная изоформа скелетно-мышечного тропонина Т1 15305458 22 35.9/6.04 32.9/5.86
2 Медленная изоформа скелетно-мышечного тропонина Т1 4507625 22 35.9/6.01 30.1/6.14
3 Медленная изоформа скелетно-мышечного тропонина Т1 15305458 29 35.9/5.96 32.9/5.86
4 Медленная изоформа скелетно-мышечного тропонина Т1 4507625 28 31.8/6.34 30.1/6.14
5 Тропонин I, быстрая скелетно-мышечная изоформа 4507621 50 21.4/7.95 21.4/8.87
6 Карбоангидраза 1 4502517 56 28.9/6.84 31.8/6.90
проведенной с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии (табл. 1). Для достижения данной цели использовался комплекс протеомных технологий, включающий применение нескольких модификаций 2Д-ЭФ в сочетании с MALDI-TOF масс-спектрометрией и некоторые другие методы.
* A
Б /
t J В /_
Рис. 1. Фрагменты двумерных электрофореграмм белков скелетной мышцы зоны исчезающих изо-форм медленного тропонина Т: А - норма, Б - больной БАС в начальной стадии заболевания, В - стадия генерализации. Стрелками отмечены исчезающие белки.
На стандартно выполненных 2Д-ЭФ (вариант I
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.