ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 8, с. 873-880
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.174.015.3:633.854.78
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ХЛОРОПЛАСТНОЙ ДНК ПОДСОЛНЕЧНИКА (Helianthus L.)
© 2015 г. Н. В. Маркин1, А. В. Усатов1, М. Д. Логачева2, К. В. Азарин1, О. Ф. Горбаченко3, И. В. Корниенко1, В. А. Гаврилова4, В. Е. Тихобаева1
1Южный федеральный университет, кафедра генетики, Ростов-на-Дону 344090
e-mail: nmarkin@mail.ru 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Москва 119992 3Донская опытная станция им. Л.А. Жданова Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур, пос. Опорный Ростовской области 346754 4Всероссийский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова, Санкт-Петербург 190000
Поступила в редакцию 24.07.2014 г.
Исследовали полиморфизм микросателлитных локусов хлоропластного генома у шести видов рода Helianthus и 46 селекционных образцов (17 ЦМС-линий и 29 Rf-линий) культивируемого подсолнечника H. annuus. Различия между видами определены по четырем SSR-локусам. Различий у культурных форм выявлено не было. Проведен сравнительный анализ последовательностей хлоро-пластной ДНК линии 3629, американской линии НА383 и линии дикой формы H. annuus. В результате определены 52 полиморфных локуса — 27 SSR и 25 SNP, которые могут быть использованы для генотипирования образцов, в том числе 8 SSR и 4 SNP — для культурных форм.
DOI: 10.7868/S0016675815060107
Полиморфизм органельных ДНК растительных организмов является предметом многочисленных эволюционных, филогенетических, по-пуляционных и экологических исследований, используется также и для изучения ядерно -цитоплазматических взаимодействий, их влияния на определенные селекционно-ценные признаки [1]. Так, например, показан ряд эффектов генов органелл на выражение количественных признаков, трансмиссию и частоту рекомбинаций отдельных локусов хромосом [2], определен их вклад в адаптационный потенциал растений [3, 4]. Одним из практических приложений этих исследований является получение растений с определенными комбинациями ядерно-цито-плазматических генов. Важным в этом случае является исследование полиморфизма внеядерных геномов, в том числе и хлоропластного. В настоящее время хлоропластный геном растений исследуют с помощью таких методов как рестрикцион-ный анализ — ЯБЬР, анализ микросателлитных локусов — 88Я, а также анализ полиморфизма нуклеотидных последовательностей генов и полных последовательностей хпДНК [5—8]. Среди них для маркирования пластома чаще применяют хлоропластные микросателлиты (ер88Я), которые представляют собой мононуклеотидные повторы с высоким уровнем вариабельности числа повторяющихся единиц в микросателлитном ло-кусе и характеризуются кодоминантным типом
наследования. С помощью 88Я-анализа был установлен более низкий уровень полиморфизма хлоропластного генома у перца [9], картофеля [10], ячменя [11, 12], подсолнечника [13, 14] и других культур по сравнению с их дикорастущими формами. Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе селекции происходит резкое снижение изменчивости геномов хлоропластов, которое может негативно сказаться на адаптационной пластичности растений. В связи с этим особый интерес представляет определение потенциала вариабельности внеядерных геномов у родственных дикорастущих видов — источников новых плазмотипов.
Цель настоящей работы — изучение полиморфизма хлоропластного генома подсолнечника у 46 линий отечественной селекции и 34 коллекционных образцов ВИР шести видов рода ИвНап-Аш, проведение секвенирования хпДНК культурной и дикорастущей форм подсолнечника, идентифицирование полиморфных локусов, которые могут быть использованы в качестве ДНК-мишеней для генотипирования хлоропластных геномов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом исследования служили 46 селекционных образцов (17 ЦМС-линий и 29 ЯГ-линий) ИвиаМкт аппыш из коллекции Донской
Таблица 1. Информативность микpоcaтeллитныx локусов xлоpоплacтного генома подсолнечника
Название локуса Последовательность праймеров (5'—3') Число аллелей Размер аллелей, пн PIC
ccmp1 F: CAGGTAAACTTCTCAACGGA R: CCGAAGTCAAAAGAGCGATT 1 137 0
ccmp4 F: AATGCTGAATCGAYGACCTA R: CCAAAATATTBGGAGGACTCT 1 126 0
ccmp5 F: GTTCCAATATCTTCTTGTCATTT R: AGGTTCCATCGGAACAATTAT 1 95 0
NTCP7 F: TGATCCCGGACGTAATCC R: CGAATCCCTCTCTTTCCG 3 191 — 193 0.39
NTCP9 F: CTTCCAAGCTAACGATGC R: CTGTCCTATCCATTAAGACAATG 7 253—270 0.76
NTCP18 F: CTGTTCTTTCCATGACCCCTC R: CCACCTAGCCAAGCCAGA 3 185—189 0.45
NTCP30 F: GATGGCTCCGTTGCTTTAT R: TGCCGGAGAGTTCTTAACAATA 3 156—158 0.28
NTCP40 F: TAATTTGATTCTTCGTCGC R: GATGTAGCCAAGTGGATCA 1 254 0
Примечание. F — прямой праймер, R — обратный праймер. PIC (Polymorphism Information Content) — индекс полиморфного информационного содержания локуса.
опытной станции им. Л.А. Жданова ВНИИМК, 34 образца пяти однолетних видов — Helianthus annuus, H. petiolaris, H. praecox, H. debilis, H. argo-phyllus и одного многолетнего H. rigidus из коллекции Всероссийского института растениеводства им. Н.И. Вавилова. В анализе полиморфизма микросателлитных локусов хпДНК использовали 3—7 растений каждого исследованного вида.
У образцов инбредных линий культурной (3629) и дикой (398941) форм H. annuus из генетической коллекции подсолнечника Южного федерального университета было проведено секвени-рование хлоропластных геномов.
Суммарную ДНК выделяли из проростков растений культурного подсолнечника и полевых образцов дикорастущих форм сорбентным методом согласно [15]. ПЦР проводили c использованием набора реагентов для амплификации ДНК ("Син-тол", Москва) по следующей программе: начальная денатурация 3 мин, 95°С (1 цикл); 30 с, 94°С, 30 с, 58—48°С (температура отжига уменьшалась на 1°С в каждом следующем цикле), 45 с, 72°С (10 циклов); 30 с, 94°С, 30 с, 48°С, 45 с, 72°С (20 циклов); заключительная элонгация 20 мин, 72°С в термоцикл ере Palm Cycler ("Corbett Research", Австралия).
Для амплификации микросателлитных локусов использовали пары праймеров, из которых прямой (F) метили 5(6)-карбоксифлуоресцеином (FAM) по 5'-концу (табл. 1). Амплифицирован-
ные фрагменты ДНК детектировали на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3130xl ("Applied Biosystems", USA). Размеры ампликонов определяли с помощью программы Gene Mapper 3.2 ("Applied Biosystems", USA), используя GeneScan ROX 500 в качестве внутреннего стандарта.
Очистку фрагментов амплифицированной ДНК для прямого секвенирования выполняли согласно [16]. Нуклеотидные последовательности определяли с использованием набора реагентов ABI Prism Big Dye Terminator v. 3.1 ("Applied Biosystems", USA) с последующим анализом продуктов на секвенаторе ABI Prism 3130xl.
Полногеномное секвенирование проводили на секвенаторе HiSeq2000 ("Illumina", USA) с длиной чтения 100 + 100. Полученные в результате секвенирования последовательности картировали на референсный xлоpоплacтный геном — последовательность xпДHK американской высокомасличной линии подсолнечника НА383 [17, номер записи в GenBank NC_007977] и затем определяли позиции, различающиеся между ре-ференсным геномом и изучаемыми образцами. Анализ проводили с помощью программы CLC Genomics Workbench v. 6.0.4.
Для оценки полиморфизма cpSSR-локусов использовали индекс PIC (Polymorphism Information
Content): PIC = i — ^p2, где p¡ — частота i-го алле-
ля, выявленного в анализируемой выборке [18].
Таблица 2. Полиморфизм микросателлитных локусов хпДНК подсолнечника
Вид Число образцов Номер интродукции ВИР Размер аллельных вариантов локуса, пн Номер гаплотипа
NTCP7 NTCP9 NTCP18 NTCP30
Культурный подсолнечник H. annuus (17 ЦМС-линий и 29 Rf-линий) 46 192 257 185 157 3
Дикорастущий подсолнечник H. annuus 7 441183 441236 441245 192 257 185 157 3
441245 192 258 185 158 6
441245 192 258 185 157 7
441245 193 253 185 157 8
H. petiolaris 7 440560 192 256 185 157 4
440560 192 255 185 157 11
503232 192 256 185 158 12
192 255 185 158 13
H. debilis 6 560388 192 256 186 157 1
560395
545666 192 255 186 157 2
560388 192 255 186 158 10
H. argophyllus 4 1805 192 256 186 157 1
1000
1805 192 255 186 157 2
H. praecox 3 560400 191 270 189 157 9
H. rigidus 7 545660 192 256 186 157 1
545681 191 257 185 157 5
545646
545646 191 256 185 156 14
1886 191 260 185 157 15
2106 192 257 185 156 16
545658 191 256 185 157 17
Всего аллелей локуса 3 7 3 3
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В работе был исследован полиморфизм восьми микросателлитных локусов хлоропластного генома (табл. 1), которые, по данным литературы, высоко вариабельны у дикорастущего подсолнечника И. аппыы8 [13, 14]. В результате сравнительного анализа линий культурного подсолнечника (17 ЦМС-линий и 29 ЯГ-линий) был выявлен только один хлоропластный гаплотип, обозначен-
ный нами как "культурный". Размер амплифици-рованных фрагментов ер88Я-локусов "культурного" гаплотипа приведен в табл. 1 и 2.
В отличие от культурного подсолнечника И. аппыы8 у шести дикорастущих видов рода Ив-НаМкыз был выявлен полиморфизм по следующим локусам: ИТСР7, ЫТСР9, ЫТСР18 и ЫТСРЗв. Полиморфные локусы у исследованных образцов представлены 16 аллельными вариантами. Их
H. annuus_441245_1_192.ab1 H. annuus_441245_2_192.ab1 H. annuus_441245_192.ab1 H. annuus_441245_193.ab1 H. petiolaris_440560_192.ab1 H. petiolaris_503232_192.ab1 H. rigidus_1_191.ab1 H. rigidus_33_192.ab1 H. debilis_545666_192.ab1 H. debilis_560388_192.ab1 H. debilis_560395_192.ab1 H. argophyllus_1805_192.ab1 H. argophyllus_1000_192.ab1 H. praecox_560400_191.ab1
CTÎ CTÎ CTÎ CTÎ CTÎ CTÎ CT i CTÎ CTÎ CTÎ CTÎ CTÎ CTÎ CT
ли
GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT GAAAAAAAT
Ai Ai Ai Ai Ai Ai Ai Ai Ai Ai Ai Ai Ai AMI
A G G G A T AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT AGGGAT
T T G С T TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT TTGCT
A AAT A A AT AAAT A A AT AAAT AAAT AAAT AAAT AAAT AAAT AAAT AAAT AAAT AAAT
TTGAAAG T T G
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.