научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА УЧАСТКОВ ЯДЕРНОЙ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК У БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ ЭНДЕМИЧНЫХ БАЙКАЛЬСКИХ ГУБОК Биология

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА УЧАСТКОВ ЯДЕРНОЙ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК У БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ ЭНДЕМИЧНЫХ БАЙКАЛЬСКИХ ГУБОК»

ГЕНЕТИКА, 2013, том 49, № 8, с. 966-974

ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ

УДК 575.86+575.174.015.3:593.4

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА УЧАСТКОВ ЯДЕРНОЙ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК У БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ ЭНДЕМИЧНЫХ БАЙКАЛЬСКИХ ГУБОК

© 2013 г. В. Б. Ицкович, О. В. Калюжная, С. И. Беликов

Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск 664033

e-mail: itskovich@mail.ru Поступила в редакцию 11.09.2012 г.

С целью изучения филогенетических отношений и уточнения таксономии проведен анализ нуклео-тидной изменчивости гена силикатеина и межгенного района мтДНК у эндемичных байкальских губок сем. Lubomirskiidae. Филогенетический анализ экзонных участков гена силикатеина al шести видов пресноводных губок выявил значительную межвидовую вариабельность данного участка. Проведенный анализ не поддерживает монофилию родов Lubomirskia и Baikalospongia. Участок мтДНК между генами COX2 и ATP6 был проанализирован у пяти видов Lubomirskiidae, включая множественные образцы B. bacillifera, для анализа внутривидовой вариабельности. Согласно результатам анализа, род Baikalospongia парафилетичен по отношению к Lubomirskia, а виды B. bacil-lifera и B. recta не формируют монофилетических групп. Молекулярные данные указывают на необходимость пересмотра таксономии Lubomirskiidae. Показано, что ускоренная эволюция у эндемичных байкальских губок сопровождается увеличением размера некодирующих областей как митохондриального, так и ядерного генома.

DOI: 10.7868/S0016675813080031

Губки (Porifera) — самые древние и примитивные многоклеточные, возраст которых около 580 млн. лет [1]. Губки отличаются значительным биоразнообразием (описано не менее 7000 видов), населяют как морские, так и пресные воды от тропиков до Антарктиды [2]. Благодаря способности к биоаккумуляции губки являются индикаторами состояния окружающей среды. Также губки — это источник большого количества биологически активных веществ, что делает актуальной разработку корректной систематики данной группы.

Пресноводные губки (отряд Haplosclerida; подотряд Spongillina) включают около 200 видов [3]. Таксономия губок основана на особенностях строения их скелетных элементов, спикул, обладающих большой морфологической вариабельностью. При неблагоприятных условиях среды космополитные пресноводные губки способны образовывать геммулы. Строение геммул и гем-москлер является важным диагностическим критерием. При этом эндемичные рода губок, населяющие древние озера, утрачивают способность к геммулообразованию из-за стабильности условий обитания.

Байкальские губки (семейства Lubomirskiidae и Spongillidae) — один из главных компонентов литоральных экосистем озера. Эндемичное семейство Lubomirskiidae представлено букетом близкородственных видов и является уникаль-

ным объектом для изучения эволюции на молекулярном уровне. Согласно существующей систематике в Байкале обитают 12 видов и два подвида эндемичного семейства ЬиЪоттклёае [4, 5]. Таксономия данного семейства затруднена и филогенетические связи между видами не изучены. У всех видов данного семейства отсутствует гемму-лообразование и их систематика основана на ограниченном количестве морфологических признаков, а именно на размерах и форме мегасклер и общем строении скелета. Недавний пересмотр систематики этого семейства позволил описать ряд новых видов, однако в сборах имеются образцы с неясным таксономическим положением [5, 6].

Молекулярные методы успешно применяются для анализа филогении пресноводных губок [7—11]. На основе анализа генов 188 рРНК и СОХ1 было показано, что эндемичные рода в древних озерах происходят от нескольких видов-основателей, при этом семейство 8роп§ЦИёае парафилетично по отношению к ЬиЪотткпёае [8]. В работах по изучению молекулярной филогении пресноводных губок отмечалась недостаточная вариабельность генов 188 рРНК и СОХ1 для анализа близкородственных видов. Исследования внутренних транскрибируемых спейсеров рРНК 1Т81 и 1Т82 показали, что эндемичное семейство ЬиЪотткь 1ёае монофилетично и происходит от спонгил-лид, родственных ЕркуйаНа тывПвп [9]. При этом генетические дистанции между байкальскими

видами — низкие, а распределение видов по родам не поддерживается. Эти данные указывают на необходимость пересмотра существующей таксономии ЬиЪотткпёае.

Для корректного построения филогении необходимо использование нескольких маркеров как ядерной, так и мтДНК с различной скоростью эволюции. Поскольку интроны и межгенные районы обладают гораздо большей скоростью фиксации мутаций, их использование в качестве маркеров для молекулярной таксономии актуально именно в случае близкородственных видов, какими и являются байкальские губки.

Силикатеины — белки, участвующие в осаждении биогенного кремнезема и входящие в состав аксиального филамента спикул. Для морских губок известны последовательности мРНК двух групп силикатеинов: а и р [12]. У пресноводных губок были идентифицированы четыре изофор-мы силикатеина а, связанные с морфогенезом мегасклер [13—15]. Была изучена дифференциальная экспрессия различных изоформ силикатеинов в процессе морфогенеза спикул у Е. Аиу!аИШ [15]. У эндемичной байкальской губки Ь. Ьа1еа1вп-

исследована экзон-интронная организация генов четырех изоформ силикатеина; показано, что космополитные и эндемичные пресноводные губки обладают сходной структурой генов, однако различаются по длине интронов [16, 17]. Гены силикатеинов представляют большой интерес в качестве маркеров видовой идентификации губок, поскольку особенности их структуры и экспрессии, вероятно, определяют морфологические особенности спикул.

Митохондриальный геном демоспонгий имеет размеры от 18 до 25 тыс. пн и кодирует от 12 до 14 белков дыхательной цепи и две рибосомаль-ные РНК. Отличие митохондриального генома губок от остальных Еите1а2оа заключается в наличии протяженных межгенных участков, которые являются местом вставки повторов, способных образовывать шпилечные структуры [18]. Первые данные о частичных последовательно -стях митохондриального генома губок показали низкую скорость эволюции мтДНК губок по сравнению с билатеральными животными [19]. Для байкальских губок было показано, что скорость накопления нуклеотидных замен в гене СОХ1 сравнима со скоростью эволюции 188 рРНК и является низкой [20]. Анализ полных митохон-дриальных геномов трех видов ЬиЪотткпёае показал, что накопление мутаций в мтДНК байкальских губок происходит в области межгенных участков [21]. Недавно было выявлено наличие вариабельности участков между генами 1ЯМЛТуг-1ЯМЛ11е и 1ЯКЛПе-1Я:ЫЛМе1 у нескольких видов байкальских губок [22]. Эволю-ционно молодые эндемичные байкальские губки

являются идеальным объектом для исследований первичного этапа накопления изменений в мтДНК. В данной работе был проведен сравнительный анализ вариабельности участков ядерной и митохондриальной ДНК у близкородственных видов Lubomirskiidae для определения подходящих молекулярных маркеров видовой идентификации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор образцов

Образцы байкальских губок были собраны в разных точках Байкала в ходе экспедиций 1997— 2008 гг. Места сбора и видовая принадлежность образцов, использованных для анализа межвидовой и внутривидовой вариабельности анализируемых участков генов, указаны в таблице. При сборе образцы замораживали в жидком азоте для молекулярного анализа и фиксировали 70%-ным этанолом для морфологического анализа. Видовая идентификация образцов была проведена на основе микроскопического изучения скелета согласно ранее описанным методикам [4, 6].

Выделение ДНК, ПЦР-анализ, определение нуклеотидных последовательностей

Выделение ДНК проводили с использованием набора Рибосорб (ИнтерЛабСервис, Россия). ПЦР-амплификацию фрагментов генов осуществляли в амплификаторе Peltier Thermal Cycler (MJ Research, USA) с использованием набора Амплисенс (ИнтерЛабСервис, Россия).

Фрагменты генов силикатеина а1 амплифици-

ровали с использованием праймеров Sil_F1 и

Sil_R1, структуры которых определены ранее исходя из наиболее консервативных участков генов силикатеинов L. baicalensis [16]:

Sil_F1 - 5'-GGTCAGTGTGGCGCTAGCTAT-GC-3';

Sil_R1 - 5'-CTGTTCTTAACAAGCCAGTAAT-3'.

Для амплификации участка между генами COX2 и ATP6 мтДНК были использованы праймеры:

ds-cox2-f1 - (5' - GGTGCAAATCATTCTTT-TATGCC-3') [D. Lavrov, частное сообщение];

atp6-rev-freshwater - (5'-CTACGTTAAAT-TGATCAAAATATGC-3') (структура праймера определена согласно последовательности мт генома L. baicalensis GU385217).

Полимеразную цепную реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси в следующем режиме: предварительный прогрев смеси, активация по-лимеразы 5 мин при 94° С; 35 циклов, включающих денатурацию ДНК (45 с при 94°С), отжиг праймеров (60 с при 56°С для силикатеин а и 50°С для COX2-ATP6) и элонгацию (90 с при 72°С); финальная элонгация (10 мин при 72°С). Индивиду-

Места и глубины сбора образцов, использованных для анализа генов силикатеина а1 и межгенного участка СОХ2—АТР6 мтДНК. Номера доступа полученных последовательностей в GenBank

Вид Номер образца Место сбора Глубина, м Номера в GenBank

Baikalospongia intermedia BK254 м. Ухан 9-12 KC477716

B. intermedia OKI о. Ольхон 15 FJ812083

B. recta BK407 г. Байкальск 8-9 KC477712

B. recta FP3 п. Листвянка 10-15 KC477723

B. bacillifera BK248 б. Варначка 13 KC477715

B. bacillifera FP1, 4, 5, 6, 7 п. Листвянка 10-15 KC477721, KC477724, KC477725, KC477726, KC477727

B. bacillifera BS143, 144, 146 п. Б. Коты 10-15 KC477718, KC477719, KC477720

Baikalospongia sp. BK385 д. Клюевка 94-145 KC477713

Baikalospongia sp. BK384 д. Клюевка 94-145 KC477714

Lubomirskia incrustans BK395 г. Байкальск 8-9 KC477711

L. incrustans OK5 о. Ольхон 15 FJ812082

L. baicalensis BK460 п. Б. Коты 10 KC477717

Baikalospongia fungiformis BS108 м. Толстый 307 GU289403

альные ПЦР-фрагменты анализировали путем электрофореза в 0.8%-ном геле агарозы, после чего экстрагировали замораживанием—оттаиванием. Секвенирование полученных фрагментов производили на автоматическом секвенаторе CEQ 8800 ("Backman Coulter Inc."). Последовательности депонированы в базу данных GenBank, номера до

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком