свою морфологию и производят рубец, в котором замуровывается поврежденная часть мозга [10]. Поэтому представляют интерес данные о структурных и функциональных особенностях рубца и терапии с целью предотвращения этого барьера [16]. В заключение, продолжает оставаться актуальной расшифровка сигналов, ведущих к нейро-нальной активации, объяснение которых обеспечит рациональную прицельную интервенцию на клеточный ответ в поврежденном мозге.
В последние два десятилетия накопились многочисленные данные в важной области нейронау-ки, связанной с выживанием нейрона: о прорастании разъединенных аксонов через поврежденный участок; их регенерации на большом протяжении; роли активаторов и ингибиторов аксонного роста; по "наведению" аксона к мишени и формированию связей с ним [8, 17]. Однако остаются неразрешенными причины резкого ограничения регенерации аксона в ЦНС, в частности, после повреждения спинного мозга (СМ) у зрелых высших позвоночных, и ведется интенсивный поиск путей регенерации и восстановления функции поврежденного центрального нейрона [17]. Эксперименты на животных моделях позволили разработать различные стратегии аксонного роста на большом расстоянии и восстановления моторной функции при повреждении СМ, из которых особое предпочтение отдается: модулированию внутриклеточных сигналов, обеспечивающих рост на большом расстоянии на тормозном субстрате и связанного с ним аксонного спраута и регенерации посредством аппликации нейротрофинов; связыванием антителами миелиновых протеинов, блокирующих аксонную регенерацию (включая стимуляцию иммунного ответа к ним терапевтической вакциной); трансплантации клеток в поврежденный участок СМ для стимуляции аксонного роста и поведенческого восстановления [18, 19]. Однако ни одно из отмеченных достижений не может быть использовано в качестве самостоятельной терапии и в перспективе остается лишь их множественная комбинация.
В последние годы акад. Галояном А. А. и сотр. открыто новое семейство обогащенных проли-ном пептидов (proline-rich peptide, PRP), которые синтезируются в гипоталамусе и аккумулируются в нейросекреторных гранулах нейрогипофиза. Расшифрована их первичная структура [20]. Показано, что семейство PRP состоит из 4 пептидов, каждый из которых проявляет специфичные свойства в отношении различных функций организма. Наиболее изученным из них является PRP-1, иммуномодулятор и нейропротектор, обладающий широким спектром биологической активности [21, 22]. PRP-1 участвует в механизмах экспрессии интерлейкинов (TNF, IL-1, IL-6) в фибробластах, макрофагах, астроцитах и активирует образование IL-1, IL-6, TNF-a в астроцитах
[23]. Исследования А. Галояна и сотр. по опосредуемой PRP-1 ингибиции проапоптотических кас-паз -3 и -9, а также активации каспаз -2 и -6 [24] явились началом изучения универсальных протекторных свойств PRP-1 при нейродегенератив-ных процессах. PRP-1 вызывает характерное изменение активности каспаз дифференцированных N2A астроцитов [24]. Более того, PRP-1 -иммуномодулятор и стимулятор иммунокомпе-тентных клеток (Т, В и макрофагов) [20], нейропротектор против многих токсических продуктов, вырабатываемых в организме и ряде микроорганизмов [23, 25, 26], регулирует миэлопоез [27], обеспечивает мощное антимикробное и антивирусное действие [25], наконец, оказывает нейротрофическое действие на биосинтез глиаль-ного фибриллярного кислого белка GFAP в астроцитах in vitro, сравнимое с действием нейротрофинов BDNF и GDNF [28], т.е. является NGF-по-добным соединением, стимулирующим секрецию таковых из нейро-глиальных элементов [28].
Как было представлено в предыдущих наших работах [29, 30], PRP-1 является универсальным соединением, предотвращающим неспецифическую нейродегенерацию, как острую, вызванную животными ядами (в частности, змеиными), так и хроническую, связанную с травмой нервной системы. В настоящей работе на спинальных крысах, подверженных предварительной латеральной гемисекции СМ (хроническая нейродегенера-ция) в различных сериях (за 2-4 и более нед постоперационного выживания), нами, на основании изучения изменения одиночных импульсных фоновых и вызванных (на стимуляцию смешанного, экстензорного и флексорного нервов) потоков нейронов СМ и гистохимического подтверждения полученных ресультатов, предпринята попытка использования нового гипоталамиче-ского нейрогормона - нейросекреторного цито-кина PRP-3, для исключения травматических последствий, связанных, в частности, с занижением электрической активности нейронов, формированием рубца с перерывом проводящих путей, ведущих к нарушению поведенческой двигательной активности (гемиплегии).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на 36 зрелых крысах-самцах (Альбино, 200-250 г.). В целом зарегистрировано 57 одиночных интернейронов (ИН) и 96 мотонейронов (МН) в экспериментах с применением PRP-3 у спинальных крыс с предварительной (за 21-22 и 27-37 дней) гемисекцией СМ без-и с использованием PRP-3. В хронических экспериментах у них под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, в/б) СМ обнажался на уровне L2-L3 посредством ламинэктомии и с правой стороны на данном уровне подвергался латеральной гемисек-
ции с помощью глазного скальпеля. Окружающая мышечная ткань и кожа зашивались, животным вводили в/м бициллин-5 и анальгин. При необходимости в первые послеоперационные дни обеспечивали вспомогательное мочеиспускание. Одной группе животных с гемисекцией СМ за 3 нед (8 крыс), за 4 нед. и более (15 крыс) вводили PRP-3 в/м в дозах 20, 10 и 5 мкг/100 г (ежедневно), 10 мкг/100 г (через день) с первого послеоперационного дня на протяжении 3 и 4 нед. Контрольная группа с гемисекцией за 1-2 (3 крысы), 3 (6 крыс) и 4 нед (4 крысы) получала физиологический раствор в идентичном соотношении. По истечении указанных послеоперационных сроков в остром эксперименте крыс обездвиживали дитилином и переводили на искусственное дыхание, затем под местной анестезией (Novokain) посредством ультразвукового ножа перерезали СМ на уровне Т2-Т3. После фиксации в стереотаксическом аппарате в люмбо-сакральной части позвоночника под новокаиновой анестезией производили ламинэктомию на уровне L3-L4. Стереотаксически ориентированные стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика 1-2 мкм, заполненные 2М раствором NaCl, вживляли в дорзальные и вентральные области серого вещества СМ (II-VI и VIII-IX пластины по Рекседу, соответственно) в сегментах L4-L5 на поврежденной и неповрежденной сторонах См для регистрации фоновой и вызванной активности одиночных ИН и МН СМ при раздражении флексорного (N. gastrocnemius, G), экстен-зорного (N. peroneus communis, P) и смешанного (N. ischiadicus, I) нервов задних конечностей с ип-си (i)- и контралатеральной (c) стороны у интакт-ных животных, подверженных гемисекции (за 14 нед) без (контроль) и с введением нейропептида PRP-3 (включая таковых после 1 нед в течение 2-х нед). Указанная модель травмы позволяет точно дифференцировать поврежденный и неповрежденный участки СМ.
Регистрацию производили на компьютере с помощью специально разработанной программы, обеспечивающей в режиме on-line селекцию спайков посредством амплитудной дискриминации и последующий вывод усредненной по количеству испытаний импульсной гистограммы для возможности выбора необходимого режима записи вызванной активности одиночного нейрона. Анализ полученных данных производили по алгоритму, детально описанному в предыдущих статьях [29, 30]. На основе PETH-гистограммы (PeriEvent Time Histogram) межспайковых интервалов вычисляли постстимульную нейронную тоническую активность (ТА), посредством последовательного усечения рассматриваемого спайкового потока исключением значений диапазонов с количеством спайков, выпадающих из интервала M ± 2SD (M - среднее значение, SD - стандартное отклонение), повторяющегося до тех пор, пока
значения среднего и SD не стабилизировались (различие менее 2%,р < 0.001). Конечную выборку принимали за ТА нейрона. По критерию %2 оценивали ее соответствие нормальному, пуассо-новскому или равномерному распределению. В зависимости от типа распределения вычисляли значимость количества спайков постстимульной гистограммы, где они выходили за пределы среднего ±2SD. Значимость различия фоновой (ФА) и ТА определяли с помощью двустороннего г-теста Стьюдента. Аналогичную задачу решали посредством кумулятивных кривых, построенных для фоновой и тонической гистограмм. По методу наименьших квадратов определяли наклон прямых, аппроксимирующих данные кривые. По наклону прямой, аппроксимирующей данный участок кумулятивной кривой, рассчитывали вероятность значимости расхождения с ТА. Все заключения статистически значимы.
Для гистохимического исследования соответствующие участки фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина в течение 1 месяца. На замораживающем микротоме приготавливали 50 цМ толщины продольные срезы. Одну часть срезов, предназначаемую для гистохимического анализа, обрабатывали в растворе FeQз • 6Н20 в течение 15-20 мин. После тщательной промывки срезы на 24 ч переносили в инкубационную смесь, приготовленную согласно модифи-рованному методу Гомори по выявлению активности кислой фосфатазы с учетом закономерности концентрационного взаимоотношения [31]. Затем срезы проявляли в 3%-ном растворе сернистого натрия и заключали в бальзам. Другую часть срезов окрашивали толуидином синим для выявления клеточной реакции.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Электрофизиологическое исследование. Проведено исследование изменения одиночной импульсной вызванной (на раздражение нервов задней конечности) активности 153 единичных ИН и МН у спинальных крыс с предварительной за 3 -(49 нейронов), 4 нед и более (27-37 дней) (104 нейрона) гемисекцией СМ без применения PRP-3 и при его использовании.
Результаты исследования изменения потока одиночной импульсной вызванной (на двустороннее раздражение смешанного, экстензорного и флексорного нервов задних конечностей) активности 253 одиночных нейронов СМ (90 ИН и 163 МН) у спинальных крыс [32-34] с целью выявления компонентного состава постстимульных реакций в норме на тех же глубинах по поперечнику СМ, на которых
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.