ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 431, № 3, с. 414-418
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 577.112.6:615.281.8
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СВОЙСТВ СТРУКТУРНЫХ ФРАГМЕНТОВ ПЕПТИДА СЕЛАНК
© 2010 г. Л. А. Андреева, И. Ю. Нагаев, М. В. Мезенцева, И. М. Шаповал, Р. Я. Подчерняева, В. Э. Щербенко, Л. А. Потапова, Л. И. Руссу, Ф. И. Ершов, академик Н. Ф. Мясоедов
Поступило 29.10.2009 г.
Задача расширения ассортимента противовирусных средств остается актуальной. До настоящего времени вирусные заболевания, такие как грипп, герпес, цитомегаловирусная инфекция и ряд других, являются наиболее широко распространенными и плохо контролируемыми инфекциями. Поэтому крайнюю важность приобретает создание новых безвредных противовирусных лекарственных препаратов. Одним из наиболее перспективных классов физиологически активных соединений, хотя и менее изученным, для создания подобных препаратов являются пептиды. Пептиды как эндогенные вещества практически лишены побочных негативных эффектов. Создание новых противовирусных лекарственных препаратов на основе пептидов является актуальной и социально значимой задачей.
Одна из основных проблем использования природных эндогенных пептидов для создания на их основе лекарственных препаратов — их полифункциональность. Ранее нами была показана возможность выделения из полифункционального пептида минимальной аминокислотной последовательности, ответственной за определенное физиологическое действие, так называемого фар-макофора [1]. Задача выявления минимальной аминокислотной последовательности, ответственной за определенные физиологические функции, важна для создания новых пептидов с определенным физиологическим действием.
Другой не менее важной задачей создания лекарственных препаратов на основе пептидов является пролонгирование их действия, так как они подвержены интенсивному протеолизу. Для про-
Институт молекулярной генетики Российской Академии наук,Москва Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук,Москва Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского
Российской академии медицинских наук,Москва
лонгирования действия создаваемых пептидов нами предложен подход, который заключается в том, что уникальные аминокислотные последовательности, ответственные за определенные функции, защищаются природными аминокислотами или их последовательностями. Присоединение новых аминокислот или их последовательностей не должно создавать дополнительных сайтов для эндопептидаз в фармакофоре. Фланкирующие аминокислотные последовательности должны легко отщепляться экзопептидазами, что в случае необходимости реализации физиологического действия фармакофора позволяет усиливать определенное физиологическое действие или придавать его действию желаемое направление.
В качестве одной из таких последовательностей оказался эффективным трипептид Рго-С1у-Рго [2]. При создании пептидов, на основе которых создан целый ряд лекарственных препаратов: семакс, селанк, С-концевую последовательность Рго-ау-Рго мы рассматривали как защитную группировку от действия протеаз. Экспериментально показано, что пептиды семакс, селанк обладают пролонгированным действием. Так, пептид семакс по сравнению со своим природным аналогом АКТГ4-10 обладает в 20 раз более пролонгированным действием [3]. Аналогично пептид селанк по сравнению с природным аналогом тафтсином обладает более пролонгированным действием [4].
Данные экспериментальных исследований последних лет показали, что глипролины (ГП) [5], и в первую очередь Рго-С1у-Рго, обладают своим специфическим физиологическим действием. Совокупность этих исследований позволила выдвинуть гипотезу о гибридности физиологических свойств пептидов типа семакс, селанк. Гибридными пептидами мы называем аминокислотные последовательности, сочетающие свойства двух или более пептидов с определенными физиологическими свойствами. В гибридном, синтетическом пептиде направленно сочетаются разные физиологические действия. Такие гибридные пептиды должны обладать свойством реализации физиологическо-
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СВОЙСТВ 415
Таблица 1. Хроматографический и масс-спектрометрический анализы пептидных последовательностей
Хроматографические Масс спектрометрические
Мол. масса характеристики характеристики
№ п.п. Пептид время удерживания, мин чистота, % [M + H]+* Фрагментация молекулярного пика**
1 Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс) 813 11.68 >98 814 545(100), 517(18), 699(33)
2 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанк) 751 7.22 >98 752 483(100), 708(98), 655(61)
3 Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 650 11.15 93 651 364(100), 382(99), 426(96)
4 Pro-Arg-Pro-Gly-Pro 522 9.14 89 523 253(100), 425(27), 407(11)
5 Arg-Pro-Gly-Pro 425 6.82 85 426 408(100) 293(54), 254(24)
6 Pro-Gly-Pro 269 5.42 >98 270 173(100), 155(98), 116(75)
7 Thr-Lys 247 1.31 97 248 230(100) 129(78), 84(30)
8 Thr-Lys-Pro 344 4.81 81 345 230(100), 212(17), 129(18)
9 Thr-Lys-Pro-Arg 500 4.65 95 501 457(100), 484(48), 272(51)
10 Thr-Lys-Pro-Gly-Pro 498 6.18 90 499 270(100), 173(11) 155(8)
11 Lys-Pro-Arg 399 4.28 75 400 364(100), 175(54), 382(34)
12 Arg-Pro 271 4.81 75 272 254(100), 175(62), 157(24)
13 Gly-Pro 172 2.40 >98 173 116(100), 127(18), 155(10)
14 Gly-Pro-Gly 229 10.53 >98 230 155(100), 127(17), 213(6)
15 Gly-Pro-Gly-Pro 326 6.02 >98 327 309(100), 173(18), 212(15)
16 Pro-Gly-Pro-Arg 425 6.7 77 426 155(100), 173(98), 116(66)
17 Pro-Gly-Pro-Leu 382 9.89 >98 383 229(100), 286(62), 337(33)
* Молекулярный пик, соответствующий иону [М + Н]+. ** Наиболее интенсивные ионы, образующиеся при фрагментации молекулярного пика при энергии ионных соударений с атомами гелия 35 эВ.
го действия составляющих его пептидов. С другой стороны, каждый из пептидов защищает другой пептид от действия протеаз. Так, пептид семакс состоит из фрагмента АКТГ4-7, обладающего способностью воздействовать на когнитивные свойства, и фрагмента Рго-О1у-Рго, обладающего ней-ропротекторными свойствами. Пептид селанк сочетает нейропротекторные и иммунотропные свойства тафтцина и нейропротекторные свойства Рго-Иу-Рго.
Ранее обнаружена противовирусная активность селанка по его способности индуцировать секрецию интерферонов, защищающих клеточные культуры от цитопатического действия вирусов. Противовирусная активность селанка показана в отношении вируса гриппа А/АкЫ/1/68 (штамм И3М2), при экспериментальной герпетической инфекции (ВПГ-2), при экспериментальном вирусном энцефаломиокардите [6, 7]. В данной работе сделана попытка выделения минимальной аминокислотной последовательности (фармакофора), ответственной за противовирусные свойства пептида селанк.
Экспериментальной основой всей работы являются структурно-функциональные исследования различных созданных на основе вышеизложенной концепции пептидных последовательностей, отбор пептидов на основе биологических исследований in vitro и in vivo, наиболее интересных для создания лекарственных препаратов направленного действия (противовирусного), и, наконец, создание как таковых новых лекарственных препаратов.
В соответствии с разрабатываемым подходом синтезировано 17 новых пептидов. Структуру фрагментов селанка создавали за счет последовательного усечения N- и С-концевых аминокислот, а также создания различных гомологичных тафтсину и Рго-Gly-Pro последовательностей. Кроме того, представляет интерес исследовать фрагменты пептида селанк с различными аминокислотными остатками на C-конце и различные ГП, также гомологичные последовательности пептида селанк. Такие подходы выявили структуры пептидов, указанных в табл. 1, 2, где представлены их некоторые характеристики. Приведены данные высокоэффективной
416 АНДРЕЕВА и др.
Таблица 2. Спектр противовирусной активности пептидов, полученный на модели культуры клеток
№ п.п. Схемы введения пептида
Пептид профилактика экстренная профилактика лечение
1 Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс) н^2 ВПГ-2 ЦМВ H5Nl ВПГ-2 ЦМВ
2 Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro (селанк) ВПГ-2 ЦМВ н^2 ВЭМК ВПГ-2 ЦМВ ВПГ-2 ЦМВ
3 Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro ВПГ-2 ЦМВ Нз^ H5N1 ВПГ-2 ЦМВ H5Nl ВПГ-2 ЦМВ
4 Pro-Arg-Pro-Gly-Pro Вирус гриппа В ВПГ-2 ЦМВ Нз^ Вирус гриппа В ВЭМК ВПГ-2 ЦМВ H5Nl Вирус гриппа В ВПГ-2 ЦМВ
5 Arg-Pro-Gly-Pro Вирус гриппа В ВПГ-2 ЦМВ HзN2 H5Nl Вирус гриппа В ВЭМК ВПГ-2 ЦМВ H5Nl ВПГ-2 ЦМВ
6 Pro-Gly-Pro НзМ2 Вирус гриппа В ВПГ-2 ЦМВ H5Nl Вирус гриппа В ВЭМК ВПГ-2 ЦМВ ВПГ-2 ЦМВ
7 Thr-Lys-Pro-Gly-Pro ВПГ-2 ЦМВ Н^2 ВЭМК ВПГ-2 H5Nl ВПГ-2
8 Thr-Lys-Pro-Arg Н^2 ВПГ-2 ВЭМК ВПГ-2 ВПГ-2
9 Thr-Lys-Pro ВПГ-2 ВЭМК ВПГ-2 ВПГ-2
10 Lys-Pro-Arg Н^2 ВПГ-2 ЦМВ ВЭМК ВПГ-2 ВПГ-2
11 Arg-Pro Н^2 ВПГ-2 ЦМВ H5Nl ВЭМК ВПГ-2 HзN2 H5Nl ВПГ-2
12 Thr-Lys ВПГ-2 ЦМВ H3N2 ВЭМК ВПГ-2 ВПГ-2
13 Gly-Pro Нз^ Вирус гриппа В ЦМВ HзN2 Вирус гриппа В ВЭМК HзN2 H5Nl ВПГ-2
14 Gly-Pro-Gly Вирус гриппа В ЦМВ HзN2 Вирус гриппа В ВЭМК Вирус гриппа В ВПГ-2
15 Gly-Pro-Gly-Pro Вирус гриппа В ЦМВ Н^2 ВЭМК Вирус гриппа В ВПГ-2 ЦМВ
Примечание. H3N2 — вирус гриппа человека A/Aichi 2/68; H5N1 — вирус гриппа А птиц (2005 год); грипп B — вирус гриппа человека B/Ohio 01/05; ВЭМК — вирус энцефаломиокардита мышей; ВПГ-2-го — вирус простого герпеса 2-го типа (гениталь-ный герпес); ЦМВ — цитомегаловирус.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СВОЙСТВ
417
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном микроколоночном хроматографе МиллиХром А-02 при использовании колонки Prontosil 120— 5C18aq, 2 • 75 мм, и элюентов (элюент А: 0.2 М LiClO4 + 5 мМ HClO4; элюент В: метанол). Все синтезированные пептиды были охарактеризованы на масс-спектрометре Thermo Electron LCQ Advantage MAX. Разработанные хроматографиче-ские условия позволяют легко получать хромато-графически чистые продукты. Для скрининга на противовирусную активность чистота всех синтезированных пептидов, приведенных в табл. 1, вполне достаточна.
Под № 1 в табл. 1 приведена структура пептида семакс, который уже нашел применение в клинической практике. Пептид семакс, будучи гибридным пептидом, состоящим из фрагмента АКТГ4-7 и трипептида Pro-Gly-Pro, имеет гомологию с пептидом селанк именно по трип
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.