научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО “ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ” НА МОДЕЛИ АДАПТИВНОГО ОТВЕТА В СОВМЕСТНОЙ КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВ ЛЮДЕЙ РАЗНОГО ПОЛА Биология

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО “ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ” НА МОДЕЛИ АДАПТИВНОГО ОТВЕТА В СОВМЕСТНОЙ КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВ ЛЮДЕЙ РАЗНОГО ПОЛА»

дических подходов: облучение in vitro отдельных клеток микропучками заряженных частиц [8], трансплантация облученных клеток костного мозга необлученным реципиентам [9], воздействие на необлученные клетки компонентами среды от облученных [10] и др.

Мы предлагаем новый, удобный метод для изучения "эффекта свидетеля" - совместное культивирование лимфоцитов разнополых доноров. Он дает возможность регистрировать уровень хромосомных аберраций (ХА) в женских (XX) клетках при облучении мужских (XY) и наоборот; исследовать адаптивный ответ в необлу-ченных лимфоцитах одного пола, культивируемых совместно с облученными в адаптирующей дозе лимфоцитами другого, изучать дозовые зависимости этих опосредованных эффектов.

В настоящей работе приводятся предварительные результаты экспериментов по изучению адаптивного ответа, проведенных на смешанной культуре лимфоцитов разнополых доноров.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Для совместного культивирования использовали лимфоциты двух здоровых доноров: мужчины в возрасте 19 лет и женщины в возрасте 27 лет.

Эксперименты проводили в трех вариантах:

1) цельную кровь (т.е. лимфоциты в стадии G0) женщины подвергали воздействию у-излучения 60Со в дозе 5 сГр (мощность дозы 3.2 сГр/мин) и, добавив фитогемагглютинин (ФГА), культивировали совместно с необлученной кровью мужчины в течение 5 ч при температуре 37°С. Через 5 ч совместного культивирования, т.е. на стадии Gl клеточного цикла, лимфоциты облучали в разрешающей дозе 100 сГр рентгеновского излучения при мощности дозы 44.5 сГр/мин на аппарате РУМ-17;

2) аналогично ставили реципрокный вариант с предоблучением мужской крови в дозе 5 сГр;

3) смешанную культуру из необлученных лимфоцитов обоих доноров облучали в дозе 100 сГр рентгеновского излучения через 5 ч после начала культивирования.

После облучения в разрешающей дозе во все культуры добавляли бромдеоксиуридин (BrdU) для контроля клеточного цикла. Снятие культур проводили стандартно через 48 ч от начала культивирования в среде следующего состава: культу-ральная среда RPMI 1640 (Биолот) - 3.8 мл, эмбриональная телячья сыворотка (Биолот) -0.7 мл, антибиотики (пенициллин + стрептомицин) в конечной концентрации 100 ед./мл и 100 мкг/мл, ФГА (Difco) в конечной концентрации 20 мкг/мл, BrdU в конечной концентрации 9.3 мкг/мл. За 3 ч

до окончания инкубирования в культуры вводили колцемид до конечной концентрации 0.1 мкг/мл.

Первый вариант опыта при сравнении с третьим, где оценивали исходную радиоустойчивость (РУ) клеток, давал возможность оценить прямой адаптивный ответ (ПАО) женских лимфоцитов и опосредованный адаптивный ответ (ОАО) мужских. Второй вариант, наоборот -ПАО мужских лимфоцитов и ОАО - женских.

Для сравнительной оценки цитогенетических эффектов однотипных радиационных воздействий в монокультурах по сравнению со смешанными дополнительно были поставлены следующие варианты культур женских и мужских лимфоцитов:

1) необлученные (монокультуры и смешанные),

2) облученные только в дозе 5 сГр (монокультуры и смешанные),

3) облученные только в дозе 100 сГр (монокультуры),

4) облученные сначала в адаптирующей дозе 5 сГр, а затем в разрешающей дозе 100 сГр (монокультуры).

Эти препараты находятся в процессе анализа и результаты по ним в настоящем сообщении не приводятся.

Анализ метафазных пластинок проводили на микроскопах Микромед-1 (ЛОМО, Россия) и Ax-ioplan (Carl Zeiss, Germany), просматривая в смешанных культурах каждого варианта по 400500 метафаз I пострадиационного митоза для каждого пола и регистрируя ХА (дицентрики, кольца, ацентрические фрагменты, маркерные хромосомы) раздельно в лимфоцитах доноров женского (ХХ) и мужского (XY) пола. Частоту событий выражали в процентах. Для оценки достоверности различий между вариантами использовали /-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные результаты представлены в табл. 1 и 2.

Видно, что предварительное облучение нести-мулированных лимфоцитов приводит к развитию ПАО у обоих доноров: частота ХА, индуцированных облучением в разрешающей дозе 100 сГр, снижается по сравнению с таковой в варианте без предварительного облучения в малой дозе на 18.2% в мужских лимфоцитах и на 22.3% - в женских. В необлученных лимфоцитах, культивированных совместно с предварительно адаптированными клетками противоположного пола, развивается ОАО по механизму "эффекта свиде-

Таблица 1. Частота индуцированных ХА в неадаптированных и адаптированных женских лимфоцитах при совместном культивировании с адаптированными и неадаптированными мужскими лимфоцитами

Хромосомные аберрации РУ неадаптированные 2 (+6 неадаптированные) ПАО адаптированные 2 (+6 неадаптированные) ОАО неадаптированные 2 (+6 адаптированные)

Число анализированных 572 570 548

клеток N % N % N %

Аберрантных клеток 211 36.9 ± 2.0 172 30.2 ± 1.9* 154 28.1 ± 1.9*

Всего аберраций 240 42.0 ± 2.1 186 32.6 ± 2.0* 162 29.6 ± 2.0*

Дицентрики + центрические кольца 154 27.0 ± 1.9 120 21.1 ± 1.7* 109 19.9 ± 1.7*

Ацентрические фрагменты 84 14.7 ± 1.5 66 11.6 ± 1.3 53 9.7 ± 1.3*

* Достоверно отличается от аналогичного показателя для РУ (р < 0.05).

Таблица 2. Частота индуцированных ХА в неадаптированных и адаптированных мужских лимфоцитах при совместном культивировании с адаптированными и неадаптированными женскими лимфоцитами

Хромосомные аберрации РУ неадаптированные 6 (+2 неадаптированные) ПАО адаптированные 6 (+2 неадаптированные) ОАО неадаптированные 6 (+2 адаптированные)

Число анализированных клеток 428 451 429

N % N % N %

Аберрантных клеток 142 33.2 ± 2.3 130 28.8 ± 2.1 117 27.3 ± 2.2

Всего аберраций 164 38.3 ± 2.3 141 31.3 ± 2.2* 133 31.0 ± 2.2*

Дицентрики + центрические 88 20.6 ± 2.0 77 17.1 ± 1.8 71 17.3 ± 1.8

кольца

Ацентрические фрагменты 74 17.3 ± 1.8 63 14.0 ± 1.6 59 13.8 ± 1.7

* Достоверно отличается от аналогичного показателя для РУ (р < 0.05).

"эффект свидетеля" по такой функциональной характеристике клетки, как способность приобретать радиоустойчивость после предварительного облучения в малой дозе. Использование совместного культивирования лимфоцитов разнополых доноров позволило оценить как прямой, так и опосредованный (т.е. развивающийся по механизму "эффекта свидетеля") адаптивный ответ женских и мужских клеток по критерию индуцированных ХА.

Известно, что среди людей существуют межиндивидуальные различия по способности развития адаптивного ответа. Они могут быть генетически детерминированы [18], зависеть от наличия у человека тех или иных соматических патологий [19], определяться степенью генотоксичности окружающей среды [20, 21]. Возможно, разная выраженность как ПАО, так и ОАО у женского и мужского доноров, обнаруженная в настоящей работе, обусловлена одной из этих причин.

теля", и уровень индуцированных в них ХА падает по сравнению с контролем (когда культура облучена только в дозе 100 сГр) на 19.1 и 29.5 % в мужских и женских лимфоцитах соответственно. В женских клетках как ПАО, так и ОАО выражены сильнее, чем в мужских, и наблюдаются по всем типам ХА, тогда как в мужских оба ответа достоверны лишь по суммам всех аберраций.

ОБСУЖДЕНИЕ

Радиационно-индуцированный "эффект свидетеля", как правило, регистрируется по различным морфологическим изменениям в необлученных клетках, соседствующих с облученными: хромосомные аберрации [11], микроядра [12], сестринские хроматидные обмены [13], мутации [14], апо-птоз [8]. В ряде работ адаптивный ответ был выявлен и по некоторым функциональным критериям: геномная нестабильность [15], опухолевая трансформация [16], изменение экспрессии генов [17]. Мы исследовали радиационно индуцированный

На выраженность адаптивного ответа существенное влияние оказывают временные схемы воздействия в адаптирующей и повреждающей дозах. Так, в работе Shadley с соавторами [22] было показано, что при облучении нестимулирован-ных лимфоцитов О0 в малой дозе, а на стадии G2 в повреждающей - частота хроматидных аберраций была такой же, как без предварительного облучения лимфоцитов. В то же время радиационное воздействие в низкой дозе на 01 лимфоциты приводило к развитию адаптивного ответа. По мнению авторов, для эффективной адаптации клеток с помощью облучения в малых дозах требуется митогенная стимуляция лимфоцитов. Не было обнаружено адаптивного ответа по тесту хромосомных аберраций в лимфоцитах и при такой схеме воздействия, когда адаптирующая и повреждающая дозы приходились на стадию G0, т.е. до внесения в среду культивирования ФГА [23]. В работе Рябченко, как и в нашем исследовании, предварительное облучение лимфоцитов проводилось на стадии G0, тем не менее авторы наблюдали достоверный адаптивный ответ при облучении в повреждающей дозе лимфоцитов 02 [20].

Результаты нашего эксперимента свидетельствуют о том, что и при использованной нами временной последовательности адаптирующей (в G0) и повреждающей (в G1) доз ионизирующей радиации может развиваться адаптивный ответ как прямой, так и по механизму "эффекта свидетеля".

По результатам большинства исследователей наиболее выраженный в количественном отношении адаптивный ответ наблюдается при пред-облучении лимфоцитов на стадии G1. Это было показано по тестам хроматидных разрывов [22], хромосомных аберраций [20, 23]. Обнаруженный в настоящей работе адаптивный ответ (как ПАО, так и ОАО) количественно был не слишком велик (20-30%), хотя и достоверен. Поэтому в дальнейших исследованиях ОАО на смешанной культуре лимфоцитов разнополых доноров планируется изменить временную схему воздействия адаптирующей и повреждающей доз таким образом, чтобы первая приходилась на стимулированные лимфоциты 01.

Таким образом, полученные в работе предварительные результаты показывают принципиальную возможность использования совместной культуры разнополых доноров для изучения ра-диационно-индуцированного "эффекта свидетеля" с помощью теста адаптивного ответа.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Рябуха А.К, Резвая СП. // Докл. АН СССР. 1970. Т. 191. № 1. С. 244-246.

2. Сафронова В.Г. // Жури. эксперим. биол. и мед. 1968. Т. 11. С. 52-55.

3. BychkovskayaIB, Ochinskaya G.K., Yudin A.L. //

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком