БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 1, с. 87 - 95
УДК 577.218
ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ АРХЕЙНОГО РИБОСОМНОГО БЕЛКА L4
© 2014 г. А.О. Михайлина1*, О.С. Костарева1, А.В. Сарских1, Р.В. Федоров2, В. Пиндл3, М.Б. Гарбер1, С.В. Тищенко1
1 Институт белка РАН, 142290 Пущино Московской обл.; факс: +7(495)514-0218, электронная почта: lisenok020388@mail.ru 2 Медицинская школа Ганновера, Институт биофизической химии, 30625 Ганновер, Германия; факс: +49 511 532-5550, электронная почта: fedorov.roman01@googlemail.com
3 Медицинский университет Инсбрука, Институт медицинской химии и биохимии, 6020Инсбрук, Австрия; факс: +43 512 9003-73110, электронная почта: wolfgang.piendl@i-med.ac.at
Поступила в редакцию 04.09.13 После доработки 02.10.13
Рибосомный белок L4 является регулятором синтеза белков S10 оперона Escherichia coli, содержащего гены 11 рибосомных белков. В настоящей работе исследованы регуляторные свойства рибосомного белка L4 из термофильной археи Methanococcusjannaschii. SW-подобный оперон M. jannaschii кодирует не 11, а пять рибосомных белков (L3, L4, L23, L2, S19), и первым белком является белок L3, а не S10. Мы показали, что MjaL4 и его мутантная форма, лишенная протяженной петли, в сопряженной системе транскрипции—трансляции in vitro специфически ингибируют экспрессию первого гена SW-подобного оперона из того же организма. Методом делеционного анализа был определен L4-связывающий регуляторный участок на мРНК MjaL3 и получен фрагмент мРНК длиной 40 нуклеотидов, необходимый и достаточный для взаимодействия с белком MjaL4.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: рибосомный белок L4, мРНК SW-подобного оперона, археи, регуляция синтеза рибосомных белков, сопряженная система транскрипции—трансляции in vitro.
Сбалансированный синтез рибосомных белков осуществляется, как правило, на уровне трансляции по принципу обратной связи, когда один из рибосомных белков, кодируемых данным опероном, является репрессором трансляции мРНК своего оперона, если синтезируется в избытке [1]. Интересным примером такой регуляции в E. coli является S10 оперон, содержащий гены 11 рибосомных белков (S10, L3, L4, L23, L2, S19, L22, S3, L16, L29, S17) [2], синтез которых регулируется как на уровне трансляции, так и транскрипции рибосомным белком L4 [3].
В рибосоме белок L4 связывается, в основном, с доменом I 23S рРНК и располагается в районе пептидилтрансферазного центра большой рибо-сомной субчастицы. Это однодоменный белок, состоящий из глобулярного домена, расположенного на поверхности 50S субчастицы, и протяженной петли, содержащей около 50 аминокислотных остатков и формирующей часть туннеля выхода полипептида [4]. При связывании с
* Адресат для корреспонденции.
рРНК неупорядоченная петля структурируется и взаимодействует с доменами II и V 23S рРНК, что способствует сворачиванию рРНК в процессе формирования рибосомы [5—7]. Тем не менее, известно, что мутантная форма белка L4, не имеющая петли, продолжает регулировать экспрессию белков S10 оперона и включается в большую рибосомную субъединицу [8].
Регуляция транскрипции и трансляции S10 оперона E. coli зависит от некодирующего ли-дерного участка мРНК с 5'-конца от первого гена рибосомного белка S10 [9]. Участки мРНК, необходимые для регуляции транскрипции и трансляции белком L4, хотя и перекрываются, но не идентичны [3]. Регуляция транскрипции осуществляется в результате механизма аттеню-ации, при котором белок L4 вместе с фактором транскрипции NusA увеличивает время паузы РНК-полимеразы на участке терминации ли-дерной мРНК, что ведет к преждевременной терминации [2]. Как правило, рибосомные белки-регуляторы связываются с участком мРНК собственного оперона, имеющим структурную
гомологию со специфическим участком связывания на рРНК [1]. Однако основной участок связывания рибосомного белка L4 на 23S рРНК не имеет явной гомологии с регуляторным участком [10, 11].
Анализ вторичных структур лидерных последовательностей S10 мРНК различных бактерий у-подкласса [12] показал наличие высокой структурной гомологии с лидерным участком E. coli, который несет детерминанты для связывания белка L4. По-видимому, во всех этих видах имеет место механизм регуляции S10 оперо-на рибосомным белком L4, аналогичный таковому в E. coli. Однако в археях нетранслируемая область мРНК S10-подобного оперона не имеет гомологии ни по первичной, ни по вторичной структуре с лидерной последовательностью мРНК S10 оперона E. coli. Первым геном S10-подобного оперона архей является ген рибосом-ного белка L3 (rpl3) [12].
Предметом наших исследований является ри-босомный белок L4 из экстремально термофильной археи M. jannaschii (MjaL4) и его мутантная форма, лишенная длинной петли (MjaL4Aloop). В данной статье показано, что белки MjaL4 и MjaL4Aloop способны специфически регулировать синтез белка L3 M. jannaschii (MjaL3) с плазмиды, содержащей 25 и более нуклеотидов (н.) 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) и ген rpl3, в сопряженной системе транскрипции—трансляции in vitro. Данный факт позволяет предположить, что MjaL4 является белком-регулятором всего S10-подобного оперона M. jan-naschii.
Был проведен делеционный анализ 5'-НТО и смысловой части мРНК MjaL3; методами гель-шифта, связывания на фильтрах и термофореза определено сродство MjaL4 к специфическим фрагментам мРНК. Получен фрагмент мРНК длиной 40 н., необходимый и достаточный для связывания с белком L4; показано, что отсутствие протяженной петли уменьшает сродство MjaL4Aloop к мРНК примерно в 3 раза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Получение генетических конструкций, несущих гены, кодирующие белки MjaL4 и MjaL4Aloop. В
соответствии с известной нуклеотидной последовательностью гена, кодирующего белок М]аЬ4 (гр4), были синтезированы олигонуклео-тиды-праймеры 1 и 2 (табл. 1) («Синтол», Россия), содержащие сайты для расщепления сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции Xba\ и ШтС111, необходимые для вставки гена в
экспрессионный вектор рЕТ-11а. Для получения гена, кодирующего белок MjaL4Aloop, также использовали частично перекрывающиеся олигонуклеотиды-праймеры 3 и 4 (табл. 1). В качестве матрицы для получения гена, кодирующего полноразмерный белок MjaL4, была использована геномная ДНК M. jannaschii. Ген, кодирующий мутантную форму MjaL4Aloop, получен с помощью метода перекрывающихся участков с использованием четырех праймеров и трех ПЦР реакций. Праймеры 1 и 4 (табл. 1) использовались для амплификации фрагмента ДНК, содержащего участок до вырезаемой петли и фрагмент после нее. Пара праймеров 2 и 3 (табл. 1) использовалась во второй ПЦР для амплификации фрагмента ДНК, содержащего участок после вырезаемой петли и фрагмент до нее. В качестве матрицы для ПЦР была использована плаз-мида рЕТ-11а, несущая ген, кодирующий белок MjaL4. Таким образом, оба амплифицирован-ных фрагмента содержали перекрывающиеся участки. Перекрывающиеся фрагменты смешивали, денатурировали и отжигали друг на друга для получения гетеродуплекса, который затем использовали в третьей ПЦР, где они амплифи-цировались в полноразмерный фрагмент с помощью двух праймеров к гену rpl4 (1 и 2).
Создание генетических конструкций, несущих ген мРНК MjaL3 (мРНК^ и его фрагменты разной длины. В качестве матриц в сопряженной системе транскрипции—трансляции E. coli были использованы четыре плазмиды, содержащие 5'-НТО разной длины и ген rpl3 под контролем Т7 промотора. Прямые праймеры 5, 7, 8 и 9 (табл. 1) содержали также последовательность Т7 промотора, обратный праймер был один — 6 (табл. 1). В качестве матрицы использовали геномную ДНК M. jannaschii.
Для создания специфических фрагментов мРНК^, содержащих участки 5'-НТО разной длины и/или смысловой части мРНК, были синтезированы олигонуклеотиды («Евроген», Россия), в которые на 5'-концах были введены сайты для расщепления рестриктазами Xmal и HindiH, необходимые для клонирования генов мРНК в вектор pUC18 (табл. 1). Гены были амп-лифицированы с помощью ПЦР и клонированы в вектор рис 18 по сайтам рестрикции XmaI и Hindlïl. Прямой олигонуклеотид содержал последовательность Т7 промотора. В качестве матрицы использовали геномную ДНК M. jan-naschii. Полученные плазмиды линеаризовали по сайту SmaI.
Выделение белков Mjal4 и Mjal4Aloop. Для получения штаммов-суперпродуцентов использовали систему Штудиера [13]. Поскольку ген rpl4 содержит кодоны для Gly, Arg и Ile, редкие в
E. coli, клетки штамма BL21(DE3) предварительно трансформировали плазмидой Rosetta, которая несет гены тРНК, узнающих редкие ко-доны (AGG/AGA (Arg), CGG (Arg), AUA (Ile), CUA(Leu), CCC (Pro), GGA(Gly)). ШтаммE. coli BL21(DE3)/Rosetta трансформировали плазмидой pET-11a, содержащей ген, кодирующий белок MjaL4 или MjaLAloop.
Клетки BL21 (DE3)/Rosetta/pET-11a_MjaL4 или BL21 (DE3)/Rosetta/pET-11a_MjaL4Aloop суспендировали в растворе, содержавшем 50 мМ Tris-На, рН 7,5; 1 M NaCl; 80 мМ MgCl2; 5 мМ ß-меркаптоэтанол (ß-МЭ) и одну таблетку коктейля ингибиторов протеаз («Ro^e Diagnostics», Германия). Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе (Sonic Dismembrator 550,
Таблица 1. Последовательности праймеров для генов, кодирующих белки М]аЬ4 и М]аЬ4А1оор, и различных фрагментов мРНК
Фрагмент гена Прямой праймер Обратный праймер
rpl4 (MjaL4) № 1 5'-CCGTTCCTCTAGAGAAGGAGATATACAT-ATGAAGGCTGTTGTTTATAATTTAAATGG-3' № 2 5'-ATCTAGAAGCTTTTATTCAAATCTCTCTT-TTA-3'
rpl4A (MjaL4Aloop) № 3 5'-GCCAAAAGGTAAAGTTGAGA-3' № 4 5'-TCTCAACTTTACCTTTTGGC-3'
5'-НТО (203 н.)_гр13 № 5 5'-CTACTGCAAAGCTTAATACGACTCACTA-TAGGACAGGTTTGCAAAATATAGT-3' № 6 5'-ATCTAGCCCGGGTTACTTACCTTGCTTT-GATGTTGTACTT-3'
5'-НТО (150 н.)_р3 № 7 5'-CTACTGCAAAGCTTAATACGACTCACTA-TAGACATTGAACGCCTTTAAGGCGTT-3' № 6
5'-НТО (50 н.)_гр13 № 8 5'-CTACTGCAAAGCTTAATACGACTCACTA-TAGCTCAAATAAAAGATTTTAA-3' № 6
5'-НТО (25 н.)_гр13 № 9 5'-CTACTGCAAAGCTTAATACGACTCACTA-TAGCAATAAATATGCTGGAGGTTAG-3' № 6
мРНКм^(-203 +100) № 5 № 10 5'-ATCTAGCCCGGGCTTCTGGCCAGCTTC-TAATTCTTCTTGG-3'
мРНКм^(-150 +70) № 11 5'-CTACTGCAAAGCTTAATACGACTCACTA-TAGACATTGAACGCCTTTAAGGCGTTC-3' № 12 5'-ATCTAGCCCGGGGTCTTTTTGCTCTTT-TTCTTGG-3'
мРН^ (-27 +7) № 13 5'-CTACTGCAAAGCTTAATACGACTCACTA-TAGGGGGATCAATAAATATGCTGGAGG
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.