НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 1, с. 54-57
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.171.55
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ОБОГАЩЕННОГО ПРОЛИНОМ ПЕПТИДА В РЕГУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
© 2014 г. Р. М. Срапионян*, З. Х. Паронян, Ф. М. Саакян, А. А. Галоян
Институт биохимии им. Г.Х. Бунятяна Национальной Академии наук Республики Армения, Ереван
Представлены результаты исследований функциональной активности гипоталамического обогащенного пролином пептида, влияющего на некоторые факторы системы гемостаза. Установлено дозозависимое ускорение гемокоагуляции в присутствии пептида, сопровождающееся активацией факторов, противодействующих свертыванию крови.
Ключевые слова: гемостаз, гемокоагуляция, обогащенный пролином пептид, фибриноген, антикоагуляция.
DOI: 10.7868/S1027813314010130
ВВЕДЕНИЕ
Гипоталамо-нейрогипофизарная система является центром нейрогуморальной регуляции, функции которого осуществляются с участием регуляторных нейропептидов, продуцируемых нейросекреторными ядрами гипоталамуса. Обогащенные пролином гипоталамические нейро-пептиды, открытые А.А. Галояном, характеризуются биологической активностью широкого спектра [1]. Один из них, ПП-1, состоящий из 15-и аминокислотных остатков, обладает имму-номодулирующими, антиоксидантными, противоопухолевыми, нейропротекторными, антибактериальными и цитокинными свойства [2]. Пептид ПП-1 является регулятором гуморального и клеточного иммунитета, миелопоеза, дифферен-цировки тимоцитов [3, 4].
На основании экспериментального материала А.А. Галоян выдвинул концепцию о нейроэндо-кринной иммунной системе мозга, значимость которой заключается в регуляции не только функционирования оси: гипоталамус—гипофиз— надпочечник, но и иммунной системы самого мозга [5].
Исследование влияния ПП-1 на систему гемостаза выявило его противосвертывающее действие на процесс агрегации тромбоцитов плазмы в условиях in vitro, что позволило предположить проявление подобных эффектов в целостном организме в системе in vivo. На основании проведенных ранее исследований тромбопластической активности ПП-1, выявивших его способность тормозить агрегацию тромбоцитов плазмы крови человека, представлялось целесообразным изучение участия
* Адресат для корреспонденции: 0014 Ереван, ул. П. Севака, 5/1, тел. 24-98- 01; e-mail: srapionyanrm@rambler.ru.
этого пептида в регуляции метаболизма ключевого фермента гемокоагуляции — маркера общего коа-гуляционного пути фактора Ха.
Было установлено, что действие ПП-1 проявляется на стадии активации фактора X (образования фактора Ха), на которой происходит "объединение" внутреннего и внешнего механизмов свертывания крови, осуществляемых после образования Ха в соответствии с одинаковыми реакциями каскада коагуляции. Показано образование комплекса фактора Ха с его ингибитором — антитромбином III (АТ III ), что позволило выявить две формы фактора Ха (Хаа и Хaß) и модифицированную форму АТ III, а также продемонстрировано высвобождение нативного АТ III, свободного фактора Ха и продуктов протеолиза последнего.
Выявлен дозозависимый бифазный эффект ПП-1, направленный на образование комплекса Ха—АТ III. При высоких дозах наблюдали активацию, а при низких — торможение данного процесса [6]. Высказано предположение о существовании нового альтернативного пути метаболизма фактора Ха, являющегося, возможно, результатом автолиза. В связи с этим, задачей нашего исследования было выяснение влияния ПП-1 на отдельные факторы системы гемостаза в опытах in vivo на фоне ее нормального функционирования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на нелинейных белых крысах-самцах Альбино массой 180—200 г. Всего было использовано 90 интактных животных, которые были разделены на две группы: особи группы 1 получали внутривенные инъекции физиологического раствора и служили контро-
лем. Животные группы 2 (65 особей) получали ПП-1 в виде инъекций в яремную вену в концентрации от 1 до 10 мкг/100 г массы тела. Кровь для исследования брали из той же вены с использованием антикоагулянта 3.8%-ного цитрата натрия в соотношении 9 : 1 через 30 и 60 мин после введения препарата и центрифугировали при 2000 об./мин в течение 10 мин. В дальнейшем изучение показателей состояния системы гемостаза проводили в плазме крови. Состояние свертывающей системы оценивали по времени свертывания крови и рекальцификации [7], показателям времени тромбообразования и активности факторов протромбинового комплекса [8]. В качестве характерных показателей состояния противо-свертывающей системы оценивали изменения толерантности плазмы к гепарину, тромбинового времени и концентрации фибриногена [9, 10].
В опытах использовали тромбин фирмы Sigma (T6884), тромбопластин фирмы Delta-THR-stb. Синтетический препарат ПП-1 получен в лаборатории природных соединений химического факультета Санкт-Петербургского Государственного университета.
Для определения статистической достоверности различий между контрольными и опытными выборками использован непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Уровень значимости р < 0.01 считали достоверным по сравнению с контролем.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Как известно, жидкое состояние крови обеспечивается динамическим взаимодействием про-коагулянтных, антикоагулянтных и фибриноли-тических реакций. Результатом этого взаимодействия является свертываемость цельной крови, позволяющая оценить ее состояние в целом.
Исследование изменения этого показателя под действием ПП-1 было проведено на интактных крысах в условиях in vivo. Полученные данные свидетельствовали о выраженном ускорении свертывания крови, зависящем от концентрации введенной дозы. Так, при низких дозах (1 мкг/100 г массы животного) наблюдается прокоагулянтный эффект, проявляющийся в сокращении времени спонтанной коагуляции на 35.5%. Увеличение дозы до 2.5 мкг замедляет процесс, либо не изменяет этот показатель, что свидетельствует о существовании предела ускорения гемокоагуляции и о до-зозависимом эффекте ПП-1 (рис. 1а).
Интерпретация данных по выявлению действия ПП-1 на время рекальцификации плазмы свидетельствует об одинаковой направленности изменений этих двух показателей. Время рекаль-цификации уменьшается через 30 мин после введения ПП-1 (1 мкг/100 г) на 44%, эффект сохра-
250
о
5 200 s
I150
6
§ 100 «
(U &
В
50
140
о 120
§ 100 я
св
^ 80 &
s я
л ч се
(U
Р
60
40
20
60 г
50
о
S
се 40
-|з0
s я
i-Q
ч 20
Л
м
<0
Р10
12
1 2 3
1 2 3
Рис. 1. Изменение показателей гемокоагуляции интактных крыс до и после введения различных доз ПП-1. Контроль — черный столбик. а — время свертывания (с); ПП-1 в дозе 1 (1) и 2.5 (2) мкг. б — время рекальцификации (с); ПП-1 в дозе 1 (1), 2.5 (2) и 10 (3) мкг. в — протромбиновое время (с); ПП-1 в дозе 1 (1), 2.5 (2) и 10 (3) мкг. * Достоверные различия между контролем и опытом (р < 0.01). Дозы приведены в расчете на 100 г массы тела животного.
няется в течение 60 мин. Увеличение концентрации введенного ПП-1 до 2 мкг ускоряет рекальцификацию плазмы на 81%, однако, более высокие дозы (до 10 мкг) снижают данный эффект до 51% (рис. 1б).
0
0
0
56
СРАПИОНЯН и др.
Рис. 2. Влияние ПП-1 на антикоагулянтную активность интактных крыс. Контроль — черный столбик. а — концентрация фибриногена (мг %); ПП-1 в дозе 5 мкг (1). б — тромбиновое время (с); ПП-1 в дозе 5 мкг (1). в — толерантность плазмы к гепарину (мин); ПП-1 в дозе 2 (1), 5 (2) и 10 (3) мкг. * Достоверные различия между контролем и опытом (р < 0.01). Дозы приведены в расчете на 100 г массы тела животного.
При определении протромбинового времени подтверждается феномен полифункциональности и дозозависимости ПП-1. Низкие дозы (1 мкг/100 г) уменьшают этот показатель на 31.3%. Наиболее выраженные изменения протромбиного времени (увеличение на 35.7%) выявляются при введении 2.5 мкг ПП-1, в то время как ПП-1 в дозе 10 мкг не изменяет данный показатель (рис. 1в).
В целом, полученные данные свидетельствуют о дозозависимых гиперкоагуляционных сдвигах вышеописанных показателей свертывания крови при низких концентрациях ПП-1, что послужило основанием для проведения специальной серии экспериментов на предмет изучения влияния ПП-1 на функциональное состояние противо-свертывающей системы.
Имеющиеся в литературе данные позволяют предположить, что ускорение свертывания крови может быть обусловлено не только увеличением активности факторов, стимулирующих коагуляцию, но и снижением уровня соединений, тормозящих его [11].
Как показали результаты настоящих исследований, введение ПП-1 интактным крысам со-
провождается угнетением функционального состояния противосвертывающей системы, что проявляется в изменениях показателей как ан-тикоагулянтного, так и фибринолитического звеньев гемостаза. Так, снижение толерантности плазмы к гепарину при введении ПП-1 в дозе 2 мкг составляет 52% в течение 30—60 мин (рис. 2в, 1). Увеличение дозы до 5 мкг вызывает снижение этого показателя до 68% (рис. 2в, 2), несколько меньше, до 25%, сокращается тромбиновое время (рис. 2б, 1), однако, отмечается увеличение концентрации фибриногена в 3.5 раза по сравнению с контрольным уровнем (рис. 2а, 1).
Кратковременное увеличение уровня фибриногена рассматривается как защитная реакция организма при нарушении деятельности проти-восвертывающей системы, что согласуется с литературными данными [11]. В свою очередь, сокращение тромбинового времени указывает на некоторое увеличение содержания тромбина, что может свидетельствовать о способности ПП-1 вызывать снижение активности ингибитора тромбина, приводящее к ускорению гемокоагуляции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, ПП-1 дозозависимо ускоряет гемокоагуляцию, однако, это сопровождается активацией системы противодействия свертыванию крови. Учитывая тесную связь между нарушением кровотока и состоянием активности структур мозга, предположения о специфической направленности воздействия гипоталамического пептида ПП-1 на сосудистую систему и его участии в предотвращении развития деструктивных процессов в крови и тканях можно считать оправданными [12].
Исследование выполнено при поддержке гранта ISTC-2009, А-1701.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Galoyan A.A. // B
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.