КОЛЛОИДНЫЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 76, № 4, с. 420-428
УДК 544.77:544.723.2:577.322.7+535.37
ИССЛЕДОВАНИЕ СШИТЫХ ПО СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОМУ МЕХАНИЗМУ БЕЛКОВЫХ ПОКРЫТИЙ НА МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦАХ МЕТОДОМ СПЕКТРАЛЬНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ
© 2014 г. А. В. Бычкова, П. Г. Пронкин, О. Н. Сорокина, А. С. Татиколов, М. А. Розенфельд
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН 119334 Москва, ул. Косыгина, д. 4 e-mail: anna.v.bychkova@gmail.com Поступила в редакцию 09.08.2013 г.
Получены наночастицы магнетита с устойчивыми покрытиями из бычьего и человеческого сывороточного альбумина. Для закрепления покрытий использован свободнорадикальный способ сшивания белков, основанный на их свойстве формировать межцепочечные ковалентные связи под действием свободных радикалов, в генерации которых участвуют ионы металлов переменной валентности на поверхности наночастиц. Впервые для описания свойств покрытий использован метод спектрально-флуоресцентных зондов с применением красителей различных классов. Продемонстрирована целесообразность использования полиметиновых и скварилиевых красителей для оценки функциональных свойств белков в составе покрытий при исследовании процессов адсорбции и свободнорадикального сшивания белка на наночастицах. Показано, что до 50% макромолекул, входящих в состав альбуминового покрытия, сшитого по свободнорадикальному механизму, сохраняют способность к связыванию с флуоресцентным красителем. Сделан вывод о сохранении белком нативных функциональных свойств в составе покрытий.
Б01: 10.7868/8002329121404003Х
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы активно развиваются такие биомедицинские области применения магнитных наночастиц (МНЧ) как гипертермия [1], магнитно-резонансные исследования [2], клеточная и молекулярная сепарация [3], тканевая инженерия [4], векторная доставка лекарственных препаратов к клеткам-мишеням [5]. Эффективность применения МНЧ для решения биомедицинских задач обеспечивается созданием функциональных покрытий, способных "нацеливать" частицы на биологические мишени и оказывающих терапевтическое воздействие [6]. Состав и свойства покрытий определяют характер взаимодействия наносистем с биологической средой и, как следствие, их эффективность. В настоящее время к покрытиям предъявляют ряд требований, среди которых биосовместимость, предотвращение процессов агрегирования наночастиц в дисперсии, устойчивость к десорбции при контакте с биообъектами. Такая устойчивость достигается путем ковалентного закрепления покрытий на поверхности наночастиц [6]. Покрытия на основе природных макромолекул, в состав которых входят белки, представляются наиболее перспективными для применения в биомедицине. Это объясняется наличием у белков способно-
сти к узнаванию биологических мишеней (белки-биовекторы) и ферментативной активности. Немаловажно, что применение белков обеспечивает биосовместимость таких покрытий [7, 8]. Сывороточный альбумин является одним из наиболее важных белковых компонентов плазмы крови. Сохранение нативной структуры альбумина при его иммобилизации на поверхности наночастиц обеспечивает их гемосовместимость и препятствует нежелательной адсорбции других белков [9].
В настоящее время для создания покрытий из белков и закрепления белковых макромолекул на поверхности наночастиц широко применяются бифункциональные сшиватели (глутаровый альдегид, карбодиимид и их производные) [10—12]. Однако их использование приводит к образованию полидисперсного ансамбля частиц в результате сшивания молекул белка, принадлежащих разным наночастицам, или, напротив, к десорбции белковых молекул с поверхности МНЧ [11]. Причина этого — неселективность сшивания поверхностного слоя адсорбированных молекул и вовлечение в процесс ковалентного связывания всех доступных сшивателю молекул, находящихся в реакционной системе. Предложенный в патенте [13] свободнорадикальный способ создания
устойчивых белковых покрытий на поверхности МНЧ позволяет формировать покрытия на индивидуальных наночастицах. Способ основан на свойстве белков подвергаться свободнорадикаль-ной окислительной модификации с образованием межцепочечных ковалентных связей [14—16]. Такие связи могут возникать в результате ряда реакций:
1) как следствие взаимодействия двух алкиль-ных радикалов, образующихся при окислении пептидной связи или боковых аминокислотных остатков
Р1Я1С- + Р2Я2С' ^ Р%С-СЯ2Р2,
2) при взаимодействии двух тирозильных радикалов
РЧуг' + Р21уг* ^ РЧуг—угР2,
3) в результате взаимодействия двух остатков цистеина с образованием дисульфидной связи
Р^Н + Р^Н + Н202 ^ Р18—8Р2 + 2Н20.
Генерация свободных радикалов протекает на поверхности МНЧ по реакции Фентона, в результате чего белки, адсорбированные на поверхности МНЧ, вовлекаются в процесс свободнорадикаль-ного сшивания. Эффективность свободноради-кального способа создания белковых покрытий на МНЧ была доказана на примерах бычьего сывороточного альбумина [17] и тромбина человека [18].
Известно, что адсорбция белков на поверхности наночастиц может приводить к изменению конформации молекул и, как следствие, к нарушению их функциональной активности [19]. Так, в работе [20] наблюдали изменения структуры сывороточного альбумина и лизоцима в результате адсорбции на наноалмазах, а также зависимость функциональных свойств лизоцима от размера (кривизны поверхности) наночастиц. Адсорбция на частицах диаметром 5 нм приводила к значительно большим потерям активности белка по сравнению с адсорбцией на наноалмазах диаметром 100 нм. В работе [21], напротив, продемонстрировано сохранение функции Тач-полимеразы при ее адсорбции на наночастицах кобальтового феррита диаметром до 20 нм. К потере белками функциональных свойств может приводить не только адсорбция, но и свободнорадикальные процессы [22—24]. В работе [18] было доказано сохранение тромбином, входящим в состав закрепленного на поверхности МНЧ по свободно-радикальному механизму покрытия, способности превращать фибриноген в фибрин.
Исследования процессов адсорбции белков на наночастицах и сохранения белками функциональных свойств осуществляются в настоящее время с применением ИК-спектроскопии, УФ-спектрофо-тометрии [20], ЭПР-спектроскопии спиновых меток и др. методов [17]. Их использование пред-
ставляет, однако, определенные трудности. Так, например, ЭПР-спектроскопия спиновых меток не позволяет проследить за изменением конфор-мации молекул на поверхности магнитных частиц. Причина заключается в наличии диполь-дипольного взаимодействия между радикалом (спиновой меткой, ковалентно связанной с адсорбированной макромолекулой) и наночасти-цей, приводящего к значительному уширению линий спектра [25]. Возможности УФ-спектро-фотометрии сводятся к количественному анализу адсорбции. Сильное поглощение наночастиц в УФ-области спектра приводит к большим ошибкам в определении оптической плотности белков. Использование ИК-спектроскопии осложнено необходимостью дополнительной подготовки образцов (нанесением на подложку и высушиванием).
В данной работе для исследования функциональных свойств белка на поверхности МНЧ использован метод спектрально-флуоресцентных зондов. При этом была поставлена задача не только получить ответ на вопрос о сохранении функциональных свойств сывороточным альбумином, закрепленным на поверхности МНЧ магнетита по свободнорадикальному механизму, но и попытаться раскрыть возможности метода при исследовании адсорбции белков и их конформацион-ных изменений на поверхности МНЧ. Таким образом, целью данной работы является изучение адсорбции сывороточного альбумина на МНЧ и сшитых по свободнорадикальному механизму белковых покрытий на МНЧ с помощью спектрально-флуоресцентных зондов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Наночастицы магнетита были синтезированы по схеме (1) соосаждением из смешанного водного раствора солей двух- и трехвалентного железа при 10° С в присутствии гидроксида аммония.
Fe2+SO4 + 2Fe3+Cl3 + 8NH4OH ^ ^ Fe3O4¿ + ^Н4)^04 + 6^4С1 + 4Н20. ( )
Соли железа FeSO4 • 7Н20 и FeC13 • 6Н20 ("х.ч.", Вектон, Россия) растворяли в количестве, соответственно, 2.68 и 5.72 г в 200 мл дистиллированной воды (мольное соотношение Fe2+ : Fe3+ = = 1 : 2) и фильтровали. Охлажденный раствор солей добавляли к 40 мл охлажденного 12.5%-ного раствора NH4OH ("ос. ч.", Химмед, Россия) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. После образования магнетита реакционную смесь помещали на магнит, выдерживали до выпадения осадка, сливали надосадочный раствор и заменяли его дистиллированной водой. Процедуру многократно повторяли до получения нейтральных значений рН. Электростатически стабилизированную дисперсию МНЧ получали
путем добавления 60 мл 0.1 М фосфат-цитратного буфера (0.05 М №С1) с рН 4.0 к магнитному осадку в условиях диспергирования с использованием ультразвукового генератора МЭФ 314 (ООО "Мелфиз-ультразвук", Россия). Затем ее центрифугировали для удаления крупных частиц. Концентрацию МНЧ в дисперсии определяли путем высушивания известного ее объема и определения массы осадка с учетом массы соединений, формирующих буфер. Концентрация МНЧ в дисперсии после центрифугирования составляла 9 мг/мл.
Покрытия из бычьего сывороточного альбумина (БСА, 81§та-АЫг1сИ, США) формировали на МНЧ по методике, изложенной в работе [17]. Для получения сшитых по свободнорадикально-му механизму покрытий из человеческого сывороточного альбумина (ЧСА, 81§та-АЫйсИ, США) использовали 2.8 мл раствора белка в 0.05 М фосфатном буфере с рН 6.5 и концентрацией 3 мг/мл, 50 мкл 3%-го раствора пероксида водорода и 0.35 мл гидрозоля магнетита с концентрацией МНЧ 9 мг/мл (образец А-НЧ-1). Образец А-НЧ-0 отличался от А-НЧ-1 отсутствием пероксида водорода. Образцы А-НЧ-0 и А-НЧ-1 инкубирова-
ли в течение 1 сут при комнатной температуре, а затем помещали в поле постоянного магнита с целью отделения наночастиц. В работе использовали также образцы н-А-НЧ-1 и н-А-НЧ-0 — надоса-дочные растворы, отобранные, соответственно, из образцов А-НЧ-1 и А-НЧ-0 в процессе магнитной сепарации. Раствор ЧСА с концентрацией 2.6 мг/мл и дисперсию МНЧ с концентрацией 1.0 мг/мл использовали в качестве контрольных об
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.