РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2015, том 55, № 4, с. 436-441
- УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ
УДК 537.86:611.08:611.91
ИССЛЕДОВАНИЕ УФ-ИНДУЦИРОВАННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ИНУЛИНАЗ © 2015 г. М. Г. Холявка*, М. Н. Нарожная, И. В. Останкова, В. Г. Артюхов
Воронежский государственный университет, Воронеж
Изучены УФ-индуцированные изменения каталитической активности и радиусов молекул инули-наз из различных продуцентов: растений, грибов, дрожжей. Установлено, что удельная ферментная активность и размеры молекулы инулиназ из Helianthus tuberosus и Kluyveromyces marxianus под воздействием УФ-света в диапазонах доз соответственно 4530—6040 и 755—6040 Дж/м2 подвержены изменению в большей степени, чем структурно-функциональные характеристики инулиназы из Aspergillus niger, что, вероятно, связано с более низким содержанием в ней таких ароматических аминокислот как тирозин и фенилаланин. Наиболее выраженная потеря функциональных свойств инулиназой из Helianthus tuberosus может быть обусловлена наличием существенно большего числа остатков цистеина в структуре молекул растительных фруктан-экзогидролаз, чем у микробных. Предложена схема отдельных этапов ответной реакции инулиназ различного происхождения на воздействие УФ-света определенного диапазона доз облучения.
Инулиназа, УФ-свет, динамическое светорассеяние. DOI: 10.7868/S0869803115040050
Фотохимические реакции в белках играют важную роль в механизмах действия ультрафиолетового (УФ)-света на живые существа. УФ-из-лучение поглощается в клетках организмов в основном белками и нуклеиновыми кислотами и оказывает мощное воздействие на многие физиологические процессы, протекающие в организме.
Изучение вопросов действия УФ-света на структуры и биосистемы различного уровня организации, в том числе и на белки-ферменты позволяет выявить механизмы деструктивно-модифицирующего, регуляторного и лечебно-профилактического действия УФ-излучения. В связи с этим работы, направленные на исследование УФ-индуцированных изменений структурно-функциональных характеристик молекул ключевых ферментов метаболизма, к которым относится инулиназа растений и микроорганизмов, необходимо развивать и детализировать.
Инулиназы (инулазы, 2,1-Р-В-фруктан-фрук-таногидролазы, КФ 3.2.1.7) расщепляют инулин и фруктоолигосахариды до фруктозы. Изучение физико-химических и структурно-функциональных свойств инулиназ в условиях различного микроокружения имеет высокое теоретическое и прикладное значение. Эти ферменты участвуют в углеводном метаболизме высших растений и
* Адресат для корреспонденции: 394006 Россия, Воронеж, Университетская площадь, 1, Воронежский государственный университет, каф. биофизики и биотехнологии; тел.: 8 (473) 220-85-86; факс: 8 (473) 220-87-55; e-mail: holyav-ka@rambler.ru.
микроорганизмов, являются важнейшими компонентами сигнальных путей системы коммуникации, играют одну из ключевых ролей в контролировании процессов клеточной дифференци-ровки, роста и развития указанных организмов. Они также могут быть использованы в циклах производства сахаров с различной степенью полимеризации, в частности, фруктозы и инулооли-госахаридов — неотъемлемых компонентов функционального питания, снижающих риск возникновения сахарного диабета, кариеса и ожирения у человека [1, 2].
Каталитическая активность ферментов определяется мобильностью структуры белковой молекулы; даже при небольших изменениях кон-формации полипептидной цепи у энзимов способность к катализу резко изменяется. В связи с этим исследование изменения структурно-функциональных свойств ферментов под действием различных денатурирующих факторов, в том числе УФ-света, остаются весьма актуальными.
В более ранней работе нами было показано, что инулиназы из Kluyveromyces marxianus, Helianthus tuberosus и Aspergillus niger образуют гетероди-меры. Продемонстрировано, что в димерной форме активность инулиназ всех указанных продуцентов ниже, чем суммарная активность их субъединиц [3]. На основании вышеизложенного можно с высокой степенью вероятности предположить, что процессы ассоциации—диссоциации молекул инулиназы и родственных ей ферментов играют важную роль в регуляции метаболизма
растении и микроорганизмов, использующих в качестве запасных питательных веществ инулин, различные фруктаны и фруктоолигосахариды. В связи с этим изучение механизмов влияния физико-химических факторов, в том числе и УФ-све-та, на процессы формирования олигомерных форм фермента и их деструкции имеет фундаментальное значение.
Учитывая важную роль инулиназы в регуляции метаболических процессов в клетках растений и микроорганизмов, а также отсутствие в литературе сведений о взаимосвязи между структурным состоянием фермента, модифицированного воздействием УФ-излучения, и проявлением его каталитической активности, представляется актуальным исследовать структурно-функциональные свойства инулиназы после УФ-облучения в широком диапазоне доз для выявления динамики фотопроцессов.
Цель работы — изучить в сравнительном аспекте УФ-индуцированные изменения каталитической активности и размеров молекул инулиназ в организмах дрожжевого, грибного и растительного происхождения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектами исследования были инулиназы из Kluyveromyces marxianus, Helianthus tuberosus и Aspergillus niger. Инулиназы (КФ 3.2.1.7) относятся к классу гидролаз, семейству гликозил-гидролаз (гликозидаз); действуют на гликозильные соединения, гидролизуют O-гликозильные связи.
Гомогенные фракции инулиназы из K. marxianus и H. tuberosus получали в лаборатории кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета. Ферментный препарат инулиназы из Aspergillus niger фирмы "Sigma Aldrich" (Германия) подвергали дополнительной очистке. Протоколы очистки препаратов приведены в работе [3].
Содержание белка в пробах определяли методом Лоури, каталитическую активность инулиназы — резорциновым методом [4]. В качестве субстрата использовали инулин с молекулярной массой 5000 Да фирмы "MP Biomedicals" (Германия) из корней цикория. За единицу ферментной активности инулиназы принимали такое количество энзима, которое катализирует образование 1 мкмоль/л фруктозы за 1 мин.
Размеры инулиназы определяли методом динамического светорассеяния на приборе "Photo-cor complex" (ООО "Фотокор", Россия) (к = 647 нм, лазер — гелий-неоновый). Форму белковой глобулы принимали за идеальную сферическую. Полученные данные обрабатывали в программе DynaLS.
2
R, нм 16 14 12 10 8 6 4 2 0
Без 151 755 1510 3020 4530 6040 облучения Дж/м
□ из Kluyveromyces marxianus
□ из Helianhus tuberosus-
□ из Aspergillus niger
Рис. 1. УФ-индуцированные изменения размеров (R) молекул инулиназы.
УФ-облучение растворов белков (в концентрации 2 х 10-5 моль/л) проводили при их непрерывном перемешивании их магнитной мешалкой в кювете, термостатируемой при 20 ± 1°С, с помощью ртутно-кварцевой лампы типа "ДРТ-400" через светофильтр "УФС-1" с полосой пропускания 240-390 нм в течение 1, 3, 5, 10, 20, 30 и 40 мин. Дозы облучения составляли соответственно 151, 453, 755, 1510, 3020, 4530 и 6040 Дж/м2.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием ¿-критерия Стьюдента, считая различия достоверными при уровне значимости <5%.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Установлено, что при облучении в дозах 755, 1510, 3020, 4530 и 6040 Дж/м2 происходит статистически значимое (~ в 2 раза) увеличение размеров молекул дрожжевой и растительной инулиназы (рис. 1), что можно рассматривать как результат разворачивания белковой глобулы или как следствие протекающих в системе процессов агрегации молекул инулиназы. При воздействии УФ-света на раствор инулиназы из Aspergillus niger процессы ассоциации ее молекул не выявляются: при всех используемых нами дозах облучения наблюдается лишь тенденция к увеличению размеров молекулы.
Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что размеры молекул инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Helianthus tuberosus после воздействия УФ-света подвержены изменению в большей степени, чем размеры белковой глобулы у инулиназы из Aspergillus niger.
Показано, что при облучении УФ-светом в дозах диапазона от 453 до 1510 Дж/м2 не происходит статистически значимых изменений активности
A, ед/мг 45
Без 151 453 755 1510 3020 4530 6040 облучения Дж/м2
□ из Kluyveromyces marxianus
□ из Helianhus tuberosus-
□ из Aspergillus niger
Рис. 2. УФ-индуцированные изменения удельной каталитической активности (А) инулиназы.
ферментов, выделенных из Kluyveromyces mar-xianus, Helianthus tuberosus и Aspergillus niger по сравнению с нативными (необлученными) образцами (рис. 2). При облучении в дозе 3020 Дж/м2 наблюдалась тенденция к снижению активности по сравнению с контрольными пробами. При облучении в дозах 4530 и 6040 Дж/м2 мы регистрировали статистически достоверное уменьшение каталитической способности на 18 и 19.5% для инулиназы из Kluyveromyces marxianus, на 21 и 26% для фермента из Helianthus tuberosus. Инули-наза из Aspergillus niger проявляла более высокую устойчивость к действию УФ-света: статистически значимое снижение ее активности (на 22%) происходило только при облучении в дозе 6040 Дж/м2.
Расширение доверительных интервалов к средним значениям удельной ферментной активности всех трех инулиназ при облучении в дозах 755, 1510 и 3020 Дж/м2, вероятно, связано с наличием в данных условиях сопоставимого по величине числа модифицированных и не модифицированных УФ-светом участков молекул белка.
При облучении образцов в дозе 151 Дж/м2 была выявлена тенденция к повышению каталитической активности ферментов из всех трех продуцентов, что указывает на возможное активизирующее действие УФ-света в указанной дозе на молекулы инулиназы.
ОБСУЖДЕНИЕ
Для объяснения полученных результатов были проанализированы первичные структуры инулиназ дрожжевого, растительного и грибного происхождения. Известно, что за функционально активное поглощение УФ-света белковыми молекулами ответственны хромофорные группы, представляющие собой остатки ароматических аминокислот: прежде всего триптофана, в значительной меньшей степени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.