научная статья по теме ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В СУБСТРАТАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ С ПОМОЩЬЮ ИНДУЦИРОВАННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ Биология

Текст научной статьи на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В СУБСТРАТАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ С ПОМОЩЬЮ ИНДУЦИРОВАННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ»

БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 3, с. 496-505

= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =

УДК 577.3

И ССЛЕДОВАНИЕ УР ОВНЯ СВОБОДНО РАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В СУБСТРАТАХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ С ПОМОЩЬЮ ИНДУЦИР ОВАННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

© 2015 г. И.М. Пискарев*, С.В. Трофимова** ***, О.Е. Бурхина***, И.П. Иванова** ***

*НИИ ядеpной физики им. Д.В. Cкобельцына Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119234, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, 1/2; **Нижегородская государственная медицинская академия МЗ PФ, 603005, Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, 10/1;

***Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, 603950, Нижний Новгород, просп. Гагарина, 23

Поступила в p едакцию 19.01.15 г. После доработки 09.02.15 г.

И сследована возможность применения индуцированной хемилюминесценции для оценки способности субстрата к перекисному окислению под действием гидроксильных радикалов и уровня свободнорадикальных процессов, которые произошли в биологических объектах, на основе анализа органических гидроперекисей в пробе. Для этого светосумма хемилюминесценции измерялась в три этапа: при введении Fe2+ в исследуемую пробу, при проведении реакции Фентона (введение Fe2+ и Н2О2) и при введении Fe2+ в пробу после проведения реакции Фентона. Измерена зависимость светосуммы от концентрации (разведения) пробы. Показано, что светосумма достигает максимальной величины при определенном разведении исследуемого субстрата. Положение максимума определяется концентрацией окисляющихся фрагментов RH, а величина светосуммы хемилюминесценции в максимуме - долей ингибитора [lnH]/[RH] и долей оказавшихся в пробе органических гидроперекисей [ROOH]/[RH].

Ключевые слова: свободнорадикальные процессы, органическая гидроперекись, индуцированная хе-милюминесценция, реакция Фентона, антиоксидант.

Реакции с участием свободных радикалов являются одной из важнейших составляющих процессов, протекающих в живых организмах. С корость таких р еакций поддерживается на определенном уровне. Повышение скор ости сво-боднорадикальных реакций может служить причиной интенсификации окислительных пр оцес-сов в клетке. Поэтому пр едполагается, что должен существовать баланс между прооксиданта-ми, поддерживающими цепное окисление, и ан-тиоксидантами, препятствующими развитию цепной реакции. Разработано и применяется много способов оценки баланса прооксидантов и антиоксидантов [1]. Эти способы основаны на инициировании окислительных реакций в пробе или препар ате р адикалами какого-либо вида и регистрации продуктов, которые могли образоваться в реакции, или наблюдении физико-химических эффектов, сопр овождающих цепную реакцию. Количественные оценки делаются на основании сравнения с калибровочной зависимостью, полученной для вещества, принятого в данных условиях за эталон. По

мнению авторов обзора [1], общего подхода для оценки прооксидантной и антиоксидантной способности не существует. Вопрос о пр имене-нии того или иного метода решается для каждой задачи конкретно.

Одним из методов исследования является индуцированная хемилюминесценция, возникающая в реакциях гидроперекисей с двухвалентным железом. П рименение активир ованной хемилюминесценции для изучения свободнора -дикальных процессов было р ассмотрено в общем виде в работе [2] и более детально в работах [3,4]. Основные закономерности про -цесса рассматривались аналитически, что неизбежно требует введение упрощающих предпо-ложений, ограничивающих применимость результатов. Метод, изложенный в работе [4], основан на измерении периода индукции, запаздывании появления излучения после введения в пробу, содержащую гидроперекиси, двухвалентного железа. Период индукции увеличивается при увеличении антиоксидантной спо-

собности пробы. Получив калибровочную кривую, связывающую период индукции с концентрацией известного антиоксиданта (например, Тролокса), вводимого в пробу, можно на основании калибровки определить антиоксидант-ную способность испытываемого образца, эквивалентную определенной концентрации эталонного антиоксиданта в этом образце. В работах [2-4] ср азу после введения железа наблюдали излучение, но анализ хар актеристик этого излучения не проводился.

Регистрация излучения, возникающего в реакции Фентона ср азу после введения всех р е-активов, применяется в практике биомедицинских исследований [5,6]. Метод позволяет оценивать защитные силы, антиоксидантную способность организма и ее изменения в процессе применения физиотер апевтических пр оцедур на основе взятой пробы (образца крови пациента). Основным преимуществом метода является возможность оперативного контроля состояния изучаемого объекта в пр оцессе применения каких-либо физико-химических воздействий, так как время измерения одной пробы составляет 30 с. Для регистрации излучения созданы прибор ы Б ХЛ-6 и Б ХЛ-7 (Нижний Новгор од). Механизм образования свечения, концентрация реагентов и процедура проведения измерений были рассмотрены в работах [7-9]. Было показано, что регистрация хемилюминесценции исследуемой пробы пр и проведении в ней р е-акции Фентона позволяет определить способность субстрата к окислению с образованием светящихся продуктов. Недостатком такого метода является неполнота получаемой информации, так как образование светящихся продуктов является только одним из каналов цепного, свободнорадикального окисления.

Следствием протекания в объекте свобод-норадикальных процессов могут быть накопленные гидроперекиси, если они не расходуются в дальнейших превращениях, происходящих в объекте (о рганизме). Концентрация гидропер е-кисей позволяет оценить интенсивность про -цессов, которые пр оизошли в объекте и в р е-зультате которых эти перекиси могли образоваться. Е сли гидропер екисей нет, это является дополнительной информацией об изучаемом процессе. Представляет интерес изучить возможность использования индуцированной двухвалентным железом хемилюминесценции и реакции Фентона для определения суммарной прооксидантной и антиоксидантной способности биологической пробы или биопрепарата. Полезную информацию можно получить из оценки интенсивности свободнор адикальных процессов в объекте, из которого взята проба,

на основе обнаружения накопленных в объекте к моменту отбора пробы органических гидро -перекисей и способности субстрата к окислению. Этому вопро су посвящена настоящая ра -бота.

Цель работы: исследование кинетики хеми-люминесценции, индуцированной введением двухвалентного железа и реакцией Фентона, в биопрепаратах, содержащих ингибитор и органические гидроперекиси. Экспериментально из-мер ена хемилюминесценция в ор ганических препар атах и выполнен расчет кинетики про -цесса путем точного численного р ешения системы дифференциальных уравнений, описывающих накопление и расходование активных частиц. Численный расчет не требует для анализа процесса применения каких-либо упрощающих предположений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

X емилюминесценция в р еакции Фентона обусловлена свечением димера синглетного кислорода, образующегося в процессе реакций, инициир уемы х гидроксильными радикалами [7]. К роме синглетного кислорода в реакции Фен-тона образуются гидроперекиси, которые не дают свечения и не могут быть непосредственно зарегистрированы. Органические гидроперекиси также могут быть и в исходной пробе. В настоящей работе о рганические гидроперекиси определяли по хемилюминесценции, возникающей после введения двухвалентного железа.

Xемилюминесценцию регистрировали био-хемилюминометром БХЛ-7 (Нижний Новгород, Россия) по следующей схеме.

Перед определением концентрации органических гидроперекисей, имеющихся в исследуемом образце, оценивали фоновое свечение про -бы S ь до введения двухвалентного железа. Свечение возникает под действием р адиацион-ного фона в помещении [10]. Оно может меняться в широких пределах (в несколько раз).

1) К исследуемому субстрату добавляли раствор двухвалентного железа (оценивали хеми-люминесценцию в реакции железа с уже имеющимися в субстр ате органическими гидропер е-кисями, получали светосумму S1).

2) К исследуемому субстрату добавляли раствор двухвалентного железа и перекись водорода (оценивали хемилюминесценцию под действием гидроксильных радикалов, генерируемых в реакции Фентона - выход светящихся продуктов, светосумма S 2).

3) Через 90 с после начала реакции Фентона к пробе 2 добавляли раствор двухвалентного

железа (оценивали хемилюминесценцию в реакции железа с начально имевшимися в субстрате и накопленными после проведения реакции Фентона гидроперекисями, получали све-тосумму S3). Двухвалентное железо, введенное ранее в пробу 2, к этому времени полностью израсходовалось [7]. Как будет показано далее, на всех трех этапах механизм обр азования свечения остается одним и тем же: светится димер синглетного кислорода, поэтому светосуммы 5Ь, S1, S2 и Sз можно непосредственно сравнивать.

Во всех случаях сразу после введения всех реагентов кювету переводили в р абочее положение: устанавливали напротив катода фотоэлектронного умножителя и затемняли, после чего автоматически начиналась регистрация излучения. Вр емя регистрации 30 с. Объем кюветы 2 мл, диаметр 1 см. Использовали реактивы: раствор РеБ04 (10-3 моль/л) в кислой среде, рН 2; раствор пер екиси водорода (10-3 моль/л). Кислую среду для растворов железа получали путем добавления сер ной кислоты в дистиллированную воду в связи с тем, что в нейтральной среде двухвалентное железо нестабильно. Выбор концентрации реагентов и условий измерений был обсужден в работе [7].

Объем проб:

1) Фоновая проба 5Ъ - без исследуемого субстрата: 0,7 мл р а створителя (вода или р а створ Хенкса).

2) П роба 1: 0,1 мл исследуемого субстрата, 0,6 мл растворителя (вода или раствор Хенкса) и непосредственно перед измерением 0,4 мл раствора Ре2+ - регистрация излучения S1.

3) П роба 2: 0,1 мл исследуемого субстрата, 0,4 мл растворителя, 0,4 мл раствора Ре2+. Последним реагентом вводили 0,2 мл перекиси водор ода - регистрация излучения S 2. Для определения фона измеряли химилюминесценцию холостой пробы S 0 - без исследуемого субстра -та, только реакция Фентона: 0,5 мл раств

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком