УДК 577.218
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЗАМЕНЫ ПРЕДПОСЛЕДНЕГО ОСТАТКА В OmpY ПОРИНЕ Yersinia pseudotuberculosis НА ЕГО ЭКСПРЕССИЮ, СТРУКТУРУ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА
© 2014 Т.Ф. Соловьева*, Н.М. Тищенко, В.А. Хоменко, О.Ю. Портнягина*, Н.Ю. Ким, Г.Н. Лихацкая, О.Д. Новикова, М.П. Исаева*
ФГУН Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022 Владивосток, просп. 100-летия Владивостоку, 159; факс: 8(423)231-4050, электронная почта: soltaf@mail.ru, issaeva@gmail.com, odd64@mail.ru
Поступила в редакцию 21.01.14 После доработки 18.03.14
Задача данного исследования состояла в сравнении гетерологичной экспрессии двух белков Yersinia pseudotuberculosis: порина OmpY дикого типа и мутантного порина OmpY, названного OmpY-Q, с нейтральным аминокислотным остатком Gln вместо положительно заряженного Arg в предпоследнем положении. Согласно литературным данным, подобная замена (Lys на Gln) предпоследнего остатка в порине PorA Neisseria meningitides приводит к значительному повышению эффективности сборки белка в наружной мембране (НМ) E. coli in vivo. Был проведен сайт-направленный мутагенез для замещения в OmpY Arg на Gln (R338Q), а также подобраны условия для экспрессии и созревания OmpY-Q. Установлено, что скорости роста штаммов E. coli, продуцирующих OmpY и OmpY-Q, и уровень экспрессии поринов были примерно одинаковыми. Сравнительный анализ рекомбинантных OmpY и OmpY-Q не обнаружил существенных различий в структуре и функциональных свойствах этих поринов и не выявил заметного влияния замены R338Q в OmpY на его сборку в НМ E. coli in vivo. Возможные причины несовпадения наших результатов с данными, полученными ранее для порина PorA, обсуждаются с использованием известных механизмов биогенеза поринов на периплазматической стадии.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Yersinia pseudotuberculosis, порообразующие белки наружной мембраны, сайт-направленный мутагенез, биогенез поринов, пространственная структура и моделирование.
Грамотрицательные бактерии наряду с внутренней (плазматической) мембраной (ПМ) имеют также наружную мембрану (НМ), которая служит защитным барьером и обеспечивает взаимодействие клетки с окружающей средой. Основными (в количественном отношении) белками НМ являются трансмембранные неспецифические порообразующие белки (порины), которые имеют структуру в-бочонка и в мембране существуют как гомотримеры. Они образуют в мембране заполненные водой каналы, проницаемые для низкомолекулярных (600 Да) гидро-
Принятые сокращения: НМ — наружная мембрана, ПМ — плазматическая мембрана, БЛМ — бислойные ли-пидные мембраны, ИПТГ — изоироиил-Р-В-1-тиогалак-топиранозид.
* Адресаты для корреспонденции.
фильных веществ, через которые в клетку поступают питательные вещества и удаляются продукты метаболизма.
Порины синтезируются в цитоплазме бактериальной клетки в виде предшественников с N концевой сигнальной последовательностью, которая отщепляется после транспортировки белков через ЦМ. Молекулярные детали процесса транслокации белков через ЦМ были относительно хорошо изучены на генетическом и биохимическом уровнях [1]. Однако более поздние стадии биогенеза поринов, в частности перемещение через периплазму к месту локализации и встраивание в НМ, еще недостаточно исследованы [2].
В периплазме бактерий присутствуют специфические белки, шапероны, которые выполняют вспомогательные функции в биогенезе пори-
нов, защищая незрелые белки от агрегации и обеспечивая их перемещение к НМ. Сворачивание белков в нативную конформацию и встраивание их в мембрану катализирует мультиком-понентная система, Bam-комплекс, который состоит из одного основного незаменимого компонента, белка Omp85/BamA, и нескольких вспомогательных белков. Число этих белков и значение для клетки неодинаково и зависит от вида бактерии.
Белки Ват-комплекса и периплазматичес-кие шапероны распознают и связываются с короткими специфическими участками последовательности незрелых поринов (частично свернутых интермедиатов), которые обычно малодоступны в нативных белках. Эти сайты связывания могут находиться как во внутренних частях молекулы белка, так и на ее С-конце.
Подавляющее большинство белков наружной мембраны бактерий (БНМ), включая пори-ны, имеют стандартно построенную С-конце-вую последовательность c небольшими видо-специфическими особенностями, появившимися в ходе эволюции [3]. Так, в большинстве БНМ Neisseria spp. предпоследним остатком с С-конца является остаток положительно заряженной аминокислоты (Arg или Lys), что не свойственно энтеробактериальным поринам, которые имеют в этом положении электронейтральный остаток глутамина. Как предполагают, этот остаток отвечает за распознавание поринов главным белком Ват-комплекса [4]. В пользу этого свидетельствует тот факт, что при экспрессии в E. coli порин PorA N. meningitidis плохо встраивается в НМ и образует конформацион-ный интермедиат, склонный к агрегации. Замещение в PorA предпоследнего лизина на глута-мин приводит к существенному увеличению количества рекомбинантного белка и его корректной сборке в E. coli.
OmpY, минорный порин с неизвестной функцией из Y. pseudotuberculosis [5], подобно PorA, содержит положительно заряженный остаток (Arg) в качестве предпоследнего остатка. По аналогии с PorA можно было предположить, что OmpY будет также некорректно сворачиваться при экспрессии в E. coli из-за неадекватного распознавания предшественника этого по-рина белком Omp85. Для проверки этого предположения, а также оценки влияния предпоследнего остатка в аминокислотной последовательности поринов на их сборку в гетерологич-ном хозяине был получен (экспрессией в E. coli) рекомбинантный мутантный OmpY (rOmpY-Q), в котором 2-й с С-конца Arg замещен на Gln (R338Q), и охарактеризован в сравнении с ре-комбинантным OmpY (rOmpY).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реактивы и бактериальные штаммы. В работе были использованы штаммы E. coli DH5a («Invitrogen», США) и BL21(DE3)-omp8 [6], реактивы для питательных бульонов LB и 2 х YT («Becton, Dickinson and Company», США), реактивы для М9 («Panreac», Испания), карбеницил-лин («Amresco», США), глюкоза («Реахим», Россия), ферменты рестрикции NdeI и XhoI («New England Biolabs», Великобритания), Т4 ДНК-лигаза («Fermentas», Литва), векторы для клонирования pTZ57R/T («Fermentas», Литва) и pET-32b («Novagen», США), наборы для очистки плазмид и ПЦР-фрагментов («Fermentas», Литва), изопропил^^-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) («Fermentas», Литва). Реактивы для ПЦР: GoTaq ДНК-полимераза («Promega», США), дНТФ («СибЭнзим», Россия), универсальные праймеры М13 («СибЭнзим», Россия), Т7 и ген-специфичные праймеры N-YPS-NdeI-F и YPS-Q-R (НПО «Евроген», Россия), коммерческие наборы для выделения фрагментов и плазмидных ДНК («Fermentas», Литва), доде-цилсульфат натрия (Ds-Na) («Bio-Rad», США), ДНКаза I («Fermentas», Литва), 0,06% водный раствор аммониевой соли 10-сульфоната^-кам-форной кислоты («Katayama Chemical», Япония), 1-моноолеоилглицерин («Sigma-Aldrich», США), акриламид («Serva», Германия), Tris-HQ («Helicon», Россия), Triton X («MP Biomedicals», США), 3,3'-диаминобензидин («Sigma-Aldrich», Германия), 2-меркаптоэтанол («Amresco», США).
Получение экспрессионной конструкции. Нук-леотидную последовательность порина OmpY Y. pseudotuberculosis с мутацией R338Q получали методом ПЦР, используя праймеры N-YPS-NdeI-F (5'-AGCATATGAAAAAACATCGCGATGG-3') и N-YPS-Q-R (5'-TGCTTAAAATTGGTAAGTCA-AGTTTACC-3'), подчеркиванием выделено место точечной мутации. Реакция проводилась в термоциклере GeneAmp® PCR System 2700 («Applied Biosystems», США) при следующих условиях: 95° — 1 мин; затем 5 циклов: 94° — 20 с, 55° — 30 с и 72° — 1 мин; затем 25 циклов: 94° — 15 с, 63° — 20 с и 72° — 1 мин; затем 72° — 15 мин. Полученный ПЦР-фрагмент (1100 п.н.) очищали, клонировали в вектор pTZ57R/T и трансформировали клетки E. coli DH5a методом электропо-рации на приборе Multiporator («Eppendorf», США) при 1700 V [7]. Отбор положительных колоний осуществляли с помощью бело-голубой селекции с последующей ПЦР на колониях с праймерами М13. Результирующую плазмиду, обозначенную как pTZ57/Y-Q, секвенировали на ДНК-анализаторе ABI Prism 3130xl («Applied Biosystems», США). Далее последовательность
ompY-Q из плазмиды pTZ57/Y-Q субклонирова-ли в вектор pET-32b по рестрикционным сайтам NdeI и XhoI. ПЦР на колониях осуществляли с прайм ерами Т7. Результирующую плазмиду pET32/Y-Q, предназначенную для экспрессии ре-комбинантного белка, секвенировали в нескольких повторах с помощью праймеров Т7. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили при использовании пакета программ MEGA4 [8].
Оптимизация условий гетерологичной экспрессии порина и получение кривых роста бактериальных культур. Для получения штамма-продуцента мутантного порина штамм E. coli BL21(DE3)-omp8 [6] был трансформирован плазмидой pET32/Y-Q. В процессе оптимизации условий экспрессии проверяли влияние на этот процесс следующих параметров: концентрации индуктора - ИПТГ (0,1, 0,25, 0,5, 1,0 мМ), концентрации репрессора — глюкозы (0,4 или 0,8%), времени индукции (0,5, 1, 2, 3 ч), температуры инкубации (16, 25 и 37°), состава питательной среды (2 х YT или М9). Трансформированные клетки наращивали в среде 2 х YT с карбеницилли-ном (50 мкг/мл) при 37° и аэрации (180 об/мин) до оптической плотности OD600 = 0,4—0,5, после чего добавляли ИПТГ. По истечении времени удаляли индуктор путем двукратной отмывки клеток средой М9, после чего клетки инкубировали в течение ночи с аэрацией в среде 2 х YT или М9 при различных температурах с карбени-циллином (50 мкг/мл) в присутствии глюкозы. Суммарный объем питательной среды для получения клеточной массы составил 3 л.
Штаммы E. coli — продуценты дикого типа и мутантного OmpY поринов — культивировали в двух повторах в течение 12 ч и определяли поглощение бактериальной суспензии при 600 нм на спектрофотометре Genesys™ 6 («Thermo Scientific», США) каждый час. На основании полученных данных были построены кривые роста клеток.
Выделение rOmpYmut. Рекомбинантный по-рин был выделен из культуры трансформированных клеток, как описано ранее [5]. Клетки цен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.