ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 5, с. 325-332
БИОХИМИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 591
ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ИХ БЕЛКОВЫХ ИНГИБИТОРОВ
В ГРЕНЕ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА © 2012 г. Д. В. Ярыгин*, Н. О. Минькова*,
*ФГБОУВПО Московский государственный гуманитарный университет имени М.А. Шолохова 109240 Москва, ул. Верхняя Радищевская, д. 16-18 ** ФГБОУВПО Московский педагогический государственный университет 129278Москва, ул. Кибальчича, д. 6 E-mail: den282@mail.ru Поступила в редакцию 02.07.09 г.
Окончательный вариант получен 17.02.12 г.
Исследована внутриклеточная локализация сериновых, цистеиновых и аспартильных протеиназ и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда в постдиапаузный период ее эмбрионального развития. Протеолитическая активность аспартильных и цистеиновых протеиназ обнаружена в лизосомальной, митохондриальной и ядерной фракциях грены. Активность сериновых протеаз не обнаружена в субклеточных фракциях грены 4 дня постдиапаузного развития. Показано, что активность белковых ингибиторов и конкретных пептидогидролаз в субклеточных фракциях обеспечивает согласованность и тонкую регуляцию функционирования протеолитического комплекса ферментов.
Ю. Б. Филиппович**
Ключевые слова: субклеточные фракции, пептидогидролазы, белковые ингибиторы, грена, тутовый шелкопряд.
Внутриклеточная локализация протеолитиче-ских ферментов и их белковых ингибиторов в тканях и органах животных изучена в той или иной степени (Коновалов, 1986; Немова, 1996; Ohshita, Kido, 1995; Zhivotovsky et al., 1995; Chapman et al., 1997). Однако, эти работы, в основном, сосредоточены на исследовании субклеточных фракций тканей позвоночных животных. Установлено, что белковые ингибиторы позвоночных локализованы в клетке в зависимости от выполняемых функций в ядерной, митохондриальной и лизосомальной фракциях, в эндоплазматическом ретикулуме, цитозоле, плазматической мембране и в других субклеточных структурах (Куцый и др., 1999; Vasilev et al., 1991; Spiess et al., 1994; Gburek etal., 1995; Wakayama, Iseki, 1997; Fabra, Cerda, 2004).
Данные о субклеточном распределении про-теолитических ферментов и белковых ингибиторов в тканях и органах насекомых крайне ограничены (Cho et al., 1999; Gan et al., 2001; Yamahama et al., 2003; Zhao et al., 2005; Yang et al., 2006, Yang et al., 2007). Исследование динамики активности пептидогидролаз и их белковых ингибиторов у насекомых в процессе их развития демонстрирует определяющую роль белковых ингибиторов про-теиназ в регуляции протеолиза в онтогенезе насе-
комых (Ярыгин и др., 2001). Существенную информацию о функциональной роли белковых ингибиторов предоставляет изучение субклеточной локализации пептидогидролаз и их белковых ингибиторов.
В настоящей работе предпринято исследование субклеточной локализации пептидогидролаз и их белковых ингибиторов в грене тутового шелкопряда.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материалом для выделения субклеточных фракций служила грена гибрида М7 х М6, представленная Миргородским гренажным заводом (Украина, Полтавская обл.), находящаяся на 4 дне постдиапаузного развития (бластокинез). Грена в этот период развития характеризуется наличием двух типов клеток — клеток развивающегося зародыша и желточных клеток. Однако основную массу клеток на данной стадии развития грены представляют желточные или питающие клетки, запасные вещества которых интенсивно используются в процессе роста и дифференци-ровки зародыша.
Субклеточное фракционирование грены тутового шелкопряда осуществляли методом диффе-
325
2*
ренциального центрифугирования (Банников, 1983). Все операции по выделению из грены субклеточных фракций проводили при 0—2°С.
Для получения субклеточных фракций навеску грены (25 г) гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса в 100 мл 0.01 М трис-НС1 буфера (рН 7.3), содержащего 0.32 М сахарозы, 5 мМ СаС12, 3 мМ MgC12 и 5 мМ КС1. Гомогенат фильтровали через капроновую ткань для отделения хориона, после чего фильтрат центрифугировали при 200 g в течение 10 мин на центрифуге К-23 ("Janetzki", Германия). Полученный осадок (клеточные обломки) отбрасывали, а из надосадочной жидкости осаждали ядра, центрифугированием при 900 g в течение 10 мин. Осадок (грубая ядерная фракция) трижды промывали 0.01 М Трис-НС1 (рН 7.3) буфером, содержащем 0.127 М NaCl, 5 мМ CaC12, 3 мМ MgC12 и 5 мМ КС1 (буфер В), каждый раз центрифугируя полученную суспензию при 900 g в течение 15 мин. Промывные воды отбрасывали, а осадок представлял собою очищенную ядерную фракцию.
Остальные субклеточные фракции выделяли методом дифференциального центрифугирования объединенного супернатанта, полученного после отделения грубой ядерной фракции. Осадок митохондриальной фракции собирали после центрифугирования супернатанта при 4500 g в течение 10 мин, а лизосомальной фракции — при 20000 g в течение 60 мин. Каждую субклеточную фракцию трижды отмывали от сахарозы буфером В.
Для освобождения от сахарозы постлизосо-мальной фракции (супернатант, полученный после выделения лизосомальной фракции), ее аликвоту подвергали диализу в течение 12 часов против 0.01 М трис-НС1 буфера, рН 7.3.
Разрушение субклеточных фракций проводили путем двухкратного замораживания и оттаивания. Полученные суспензии центрифугировали при 15000 g в течение 30 мин, используя в дальнейшем супернатанты в качестве исходных препаратов для выявления в них активности протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов.
Чистоту полученных субклеточных фракций контролировали измерением в них активности маркерных ферментов: в митохондриальной фракции — цитохром-с-оксидазы, в лизосомальной — кислой фосфатазы (Кривченкова, 1977, Морозова, Безбородова,1972).
Содержание белка в экстрактах субклеточных фракций определяли по методу Лоури (Lowry et a1., 1951).
Общую протеолитическую активность растворимых белков грены тутового шелкопряда определяли по методу Ансона (Anson, 1939), модифицированному для выявления активности пепти-догидролаз в тканях и органах тутового
шелкопряда (Клунова и др., 1987). С этой целью к 0.15 мл 1%-ного раствора гемоглобина в фосфат-но-цитратном буфере (рН 2.2—7.2), либо 0.5%-ного раствора казеина в 0.2 М боратном буфере (рН 7.2-8.0) и в 0.05М боратном буфере (рН 9.010.2) добавляли 0.2 мл ферментного экстракта, содержащего до 300 мкг белка. Полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 16 ч, а затем реакцию останавливали добавлением к реакционной смеси 0.24 мл 10%-ного раствора трихлорук-сусной кислоты (ТХУ). В контрольных вариантах ТХУ добавляли к смеси одновременно с ферментным экстрактом. Полученные смеси помещали на 10 мин в холодильную камеру для формирования осадка, который отделяли центрифугированием при 8000 g. К 0.3 мл полученного супернатанта добавляли 0.6 мл 0.5М NaOH и 0.18 мл реактива Фолина (0.7 н.). Через 5 мин определяли оптическую плотность реакционной смеси при 750 нм. Измерение активности трипсино- и хи-мотрипсиноподобных протеиназ проводили спектрофотометрическим методом, описанным в руководстве "Preparations for biochemistry" фирмы "Merck" (Германия), используя в качестве субстратов растворы ^бензоил^Х-аргинил-п-нитроанилида (BAPNA) и сукцинил^Х-фенил-аланин-п-нитроанилида (SUPHEPA) в диметил-формамиде из расчета 5 мг/мл. За единицу про-теолитической активности грены тутового шелкопряда принимали такое количество ферментного препарата, которое вызывало увеличение оптической плотности на 0.01 при длине волны 750 нм в случае применения природных субстратов и при длине волны 405 нм в случае использования синтетических субстратов.
Для определения подклассовой принадлежности протеолитических ферментов, выявленных в субклеточных фракциях в грене тутового шелкопряда, использовали ингибиторный анализ с применением специфических ингибиторов про-теиназ соответствующих подклассов: в качестве ингибитора сериновых протеиназ - фенилметил-сульфонилфторида, цистеиновых протеиназ -п-хлормеркурибензоата, аспартильных протеи-наз - пепстатина и металлопротеиназ - этиленди-аминтетраацетата. Концентрация всех вышеперечисленных ингибиторов составляла 1 х 10-3 М. Оценивая влияние тех или иных ингибиторов, вычисляли долю (% от контроля) остаточной активности фермента в присутствии соответствующего эффектора.
О наличии эндогенных ингибиторов пептидо-гидролаз в субклеточных фракциях грены тутового шелкопряда судили по торможению активности соответствующих коммерческих препаратов протеиназ (папаина, пепсина, трипсина и химот-рипсина) в присутствии ферментных экстрактов грены. Эндогенную ингибиторную активность по отношению к протеолитическим ферментам
ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ КОМПЛЕКСА
327
(трипсину и химотрипсину) определяли спектро-фотометрически по расщеплению синтетических субстратов ВАРНА и SUPHEPA. Эксперимент проводили с использованием трех серий проб. Все серии и пробы были унифицированы по объемам и количеству одноименных компонентов, времени и условиям инкубации. Первая серия представляла собою контроль, в котором активность коммерческого препарата фермента проявлялась в исходном варианте. Пробы содержали 0.3 мл буфера с соответствующим значением рН, 0.15 мл раствора модельного субстрата (500 мкг) и 0.05 мл раствора фермента (15 мкг). Опытные пробы второй серии, кроме перечисленных компонентов, содержали 0.2 мл исходного экстракта (0.1 мг белка). На образование комплекса фермент-ингибитор отводилось 20 мин, по истечении указанного времени в инкубационную среду вносили раствор субстрата и пробы выдерживали 40 мин при комнатной температуре. Третья серия проб представляла собой контроль, позволяющий тестировать возможную активность эндогенных протеаз по отношению к вносимым субстратам и маскирующим действие ингибитора. Пробы третьей серии содержали буфер, субстрат и исходный белковый экстракт. Варианты каждой серии имели собственные контроли на реагенты. Реакцию останавливали добавлением к инкубационной среде 1.5 М раствора уксусной кислоты и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 405 нм. Активность эндогенных ингибиторов выражали либо в процентах от исходной
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.