ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2012, № 5, с. 486-492
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 639.3.09
ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ФУРУНКУЛЕЗОМ, ВЫЗВАННЫМ ИНФИЦИРОВАНИЕМ Aeromonas salmonicida, У ЛОСОСЕВЫХ РЫБ ЮЖНОЙ ЧАСТИ ОСТРОВА САХАЛИН
© 2012 г. Е. В. Галанина*, А. В. Ломакина**
*Сахалинский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, 693023 Южно-Сахалинск, ул. Комсомольская, 196 **Лимнологический институт СО РАН, 664033 Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3
E-mail: galanina@sakhniro.ru Поступила в редакцию 06.06.2011 г.
Проведены ихтиопатологические исследования производителей лососевых рыб юга о. Сахалин. Выявлены случаи заболеваний фурункулезом. Выделен возбудитель заболевания Леготопаз заЫвт-Ма. Изучены его морфологические, физиолого-биохимические и антагонистические свойства, определена вирулентность выделенных штаммов. Для подтверждения видовой принадлежности исследованных штаммов Л. salmonicida был проведен молекулярно-генетический анализ.
Заболевание фурункулезом у рыб известно в Европе с 1894 г., в США — с 1902 г. В настоящее время это заболевание регистрируется в Испании, Дании, Японии, Корее, США, России (Nomura et al, 1993; Pedersen et al, 1994; Bowden et al, 1999; Pirhonen et al., 2003; Шкурина, 2004). Фурункулезу наиболее подвержены разводимые в искусственных условиях рыбы: палия, ручьевая форель, радужная форель, а также все виды лососевых рыб естественных водоемов (Snieszko, 1974; Bullock, Roberts, 1980). Болезнь зарегистрирована как у пресноводных (сигов, линей, карпов, щук, окуней), так и у морских рыб (сельди, трески, палтуса и др.) (Hjeltnes et al., 1995; Traxler, Bell, 1998).
Исследования фурункулеза и возбудителя этого заболевания Aeromonas salmonicida на о. Сахалин начались в середине семидесятых годов прошлого века. Впервые случай заболевания фурункулезом с выделением возбудителя A. salmonicida был зарегистрирован в 1973 г. в естественной популяции лососевых в р. Очепуха врачом ветеринарной лаборатории И Сун Дя (1975). С этого момента на Сахалине регистрируются единичные случаи заболевания производителей лососевых фурункулезом.
Фурункулез — это высококонтагиозная болезнь, представляющая большую опасность для культивируемых лососей, выращиваемых до товарного размера, вспышки которой могут приводить к 100%-ной гибели рыб. На Дальнем Востоке лососей не выращивают до товарного состояния, а выпускают в водоемы на естественный нагул (на ювенильной стадии развития) в возрасте 0+. Этот факт не учитывался, и регистрация заболевания с
выделением возбудителя фурункулеза на о. Сахалин привела в 80-е г. XX в. к наложению карантина почти на все лососевые рыбоводные заводы. Наложение карантина мешало нормальной работе лососевых рыбоводных заводов, поскольку препятствовало перевозке икры, которая осуществлялась в 70-80-х гг. XX в. не только в пределах области, но и по всему Советскому Союзу и за рубеж (США, Япония). Поэтому для изучения возбудителя заболевания и контроля эпизоотической ситуации не только на Сахалине, но и на всем Дальнем Востоке была создана Дальневосточная зональная ихтиопатологическая инспекция (ДЗИИ, Южно-Сахалинск). Инспекция функционировала с 1977 г. по 1988 г., а с 1992 г. по настоящее время специалисты ДЗИИ работают в лаборатории болезней рыб СахНИРО, где проводятся ихтиопатологиче-ские исследования.
Цель исследования — проведение анализа заболеваемости лососевых рыб юга о. Сахалин, идущих на нерест, и оценка степени их зараженности фурункулезом, изолирование возбудителя, описание его морфологических и физиолого-биохи-мических свойств, вирулентности, проведение молекулярно-генетической идентификации выделенных культур бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
С 1992 г. по 2008 г. в период нереста было клинически осмотрено 23120 экз. производителей горбуши и 5117 экз. кеты, выловленных из нерестовых рек юга о. Сахалин. Бактериологическому анализу подвергали внутренние органы рыб (почка, печень), содержимое язв и фурункулов. От производителей горбуши для микробиологиче-
ских исследований было отобрано 465 проб, от производителей кеты — 106 проб. В рыбоводные сезоны 1992—2008 гг. (с октября по июнь) на лососевых рыбоводных заводах обследованы икра и молодь, выполнено 228 посевов икры и 670 посевов молоди лососевых. Во время ската на реках Кура, Бахура, Фирсовка, Таранай, Брянка, Бую-клинка была отобрана дикая молодь для ихтиопа-тологических исследований.
Бактериологические исследования проводили по общепринятым в ихтиопатологии методикам (Мусселиус и др., 1983). Первичные посевы материала от икры, молоди, производителей проводили на рыбо-пептонный агар (РПА) и рыбо-пеп-тонный бульон (РПБ). Культурально-биохимиче-ские характеристики выделенных культур изучали с применением дифференциально-диагностических сред, систем индикаторных бумажных (СИБ) с набором из 16 основных тестов (НПО "Микроген", Москва), а также микро-тестсистем API 20E для идентификации энте-робактерий и API 20NE для идентификации грамнегативных палочек не энтеробактерий (bioMerieux, Франция). Видовую идентификацию бактерий проводили, используя Определитель бактерий Берджи (1997).
В 2008 г. были исследованы на вирулентность четыре штамма A. salmonicida, выделенные от производителей горбуши, выловленных на забойках трех лососевых рыбоводных заводов (Фирсовка, Таранайский, Лесной). Штаммы условно промаркированы: A, B, C, D. Штамм A выделен от горбуши с завода "Фирсовка", штамм — B от горбуши с завода "Лесной", штаммы C и D — от горбуши с завода "Таранайский". Штаммы A—C выделены от рыб с клиническими признаками бактериального заболевания, штамм D — от самки горбуши без клинических признаков. Вирулентность культур выявляли согласно методическим указаниям по определению патогенности аэромонад (МУ № 13-4-2/1116, 1997).
Антагонистические взаимоотношения микроорганизмов изучали по методике, описанной в Справочнике по микробиологическим и вирусологическим методам исследования (1982)
Молекулярно-генетическая идентификация выделенной культуры проведена в отделе микробиологии ЛИН СО РАН (Иркутск). Выделение ДНК проводили по методу Рошель (Rochelle, 1992). Для синтеза фрагмента гена 16S рРНК использовали праймеры широкой специфичности для этого локуса эубактерий (27F — AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG; 1350R - CAC GGG CGG TGT GTA CAA G). ДНК амплифицировали на амплификаторе БИС (Россия). Использовали состав реакционной смеси и условия амплификации ДНК, описанные ранее (Шубенкова и др., 2005).
Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, и визуализировали в ультрафиолетовом свете. Очистку продуктов полиме-разной цепной реакции (ПЦР) проводили путем их экстракции из участков геля, содержащих продукты ожидаемой длины.
Секвенирование фрагментов гена. Для элюции нуклеотидного материала кусочки геля замораживали при —20°С, затем центрифугировали в микропробирке объемом 1.5 мл 20 мин на микроцентрифуге Eppendorff miniSpin (Германия) при 13.4 тыс. об./мин. Супернатант, содержащий ПЦР-продукт, отбирали и использовали для се-квенирования. Реакцию Сэнгера производили с помощью автоматического секвенатора нуклеиновых кислот CEQ8800 (Backman, США) и 373А DNA Sequencer (Backman).
Филогенетический анализ. Полученная в ходе работы нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16S рРНК была депонирована в базу данных GenBank под номером HQ533268. Ближайших гомологов для полученной последовательности находили с использованием поисковой программы BLAST сервера NCBI в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) (Altschul et al., 1997). Редактирование последовательностей проводили в редакторе BioEdit (Thompson et al, 1994), выравнивание — с использованием алгоритма CLUSTALW Филогенетическое дерево было построено методом объединения ближайших соседей (NJ) с 2-параметровым алгоритмом Кимуры в программе MEGA версия 4.0 (Tamura et al., 2007). Показатель достоверности порядка ветвления определяли на основании bootstrap-анализа 100 альтернативных деревьев. Для построения филогенетического дерева, кроме ближайших родственников из базы данных GenBank, использовали нуклеотидные последовательности типовых штаммов различных видов рода Aeromonas (GenBank Acc. No. X74679, X74684, X71120, DQ207728, S39232) для подтверждения принадлежности исследуемого штамма к виду A. Salmonicida.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
За все время исследований Л. salmonicida из икры и молоди лососевых рыб не была выделена ни разу. Возбудитель фурункулеза выделялся от нерестовой горбуши и кеты в реках эпизодически. Наиболее часто фурункулез регистрировали у горбуши юго-восточного побережья о. Сахалин (реки Очепуха, Бахура, Долинка) и в зал. Анива (реки Таранай, Люто га), у кеты в зал. Терпения (р. Буюклинка).
0.01
89 75
Aeromonas salmonicida GQ266405 (выделен из Atlantic -salmon, Чили)
A. salmonicida NR 025001 (типовой штамм) A. salmonicida strain 8 HQ533268
Aeromonas hydrophila AB472904 (выделен из пресноводной . рыбы, Япония, Осака)
L Aeromonas sp. AM913921 (выделен из Laminaria saccharina) Aeromans media X74679
99 L A. hydrophila DQ207728 _ Aeromonas allosaccharophila S39232 Aeromonas ichthiosmia X71120 99 L Aeromonas veronii X74684
■ Desulfurococcus mobilis M36474
Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена 16S рРНК чистой культуры A. salmonicida (жирный шрифт), выделенной из лососевых рыб, идущих на нерест. Масштаб: 1 нуклеотидная замена на каждые 100 нуклеотидов. Цифры — статистическая достоверность ветвления, определенная с помощью bootstrap-анализа альтернативных деревьев. Значения менее 75 не указаны.
Частота встречаемости половозрелых лососей, больных фурункулезом в период нереста на юге Сахалина с 1992 г. по 2008 г., представлена в табл. 1, 2.
В возникновении и развитии заболевания у лососевых рыб важную роль играют абиотические и биотические факторы среды. К абиотическим относятся: температура воды выше 20°С, которая способствует активному развитию возбудителя и наращиванию его численности, и низкая концентрация растворенного кислорода в во
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.