научная статья по теме ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНОМА ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНОМА ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 2, с. 252-259

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 575.174.015.3

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНОМА ДРОЖЖЕЙ УАЯЮП^М 11Р01УТ1СА © 2010 г. Е. С. Наумова, Е. В. Серпова, Г. И. Наумов1

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва Поступила в редакцию 04.05.2009 г.

С помощью анализа последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров и ГГ£2,

ИАРВ-ИЦР и пульс-электрофореза нативных хромосомных ДНК изучены молекулярно-генетические особенности геномов 40 штаммов Уагтота Иро1уИса различного происхождения. Все штаммы имели практически идентичные последовательности П^-участков. В то же время, молекулярное кариотипи-рование выявило значительный полиморфизм кариотипов У Иро1уИса. Размеры и порядок индивидуальных хромосом варьировали у разных штаммов. Обнаруженные различия не связаны с географическим происхождением дрожжей и источником их выделения. Обсуждается внутривидовой полиморфизм хромосом У. Иро1уИса.

Ключевые слова: Уаггом>1а Иро1уйса, диморфные дрожжи, 5.8$-ГТ£, хромосомная ДНК, молекулярное ка-риотипирование, филогенетический анализ.

Генофонд дрожжей, используемых в фундаментальных и прикладных исследованиях, постоянно расширяется. Привлекаются новые перспективные микроорганизмы с необычными, важными свойствами; к числу последних относятся и диморфные дрожжи Yarrowia lipolytica, продуценты разнообразных физиологически активных веществ, включая гидролитические ферменты. Полноценное использование этих дрожжей невозможно без знания их молекулярно-генетических особенностей. По фи-зиолого-генетическим и молекулярным характеристикам Y. lipolytica кардинально отличается от хорошо изученных дрожжей Saccharomyces cerevisiae [1, 2]. Сравнительный анализ более 40 полноразмерных грибных геномов показал, что дрожжи Y. lipolytica представляют собой отдельную филогенетическую ветвь и генетически неродственны остальным видам аскомицетовых дрожжей [3]. Определение полной нуклеотидной последовательности генома Y. lipolytica на материале генетической линии CLIB122 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) создало хорошую основу для изучения видовых и штаммовых особенностей этих дрожжей.

Современная генетика и молекулярная систематика позволяют однозначно проводить видовую и штаммовую идентификацию дрожжей на основе молекулярных маркеров, включая как отдельные гены, нуклеотидные последовательности, так и целые хромосомы. Для установления филогенетического родства дрожжей и определения их видовой принадлежности применяется анализ последовательностей генов рибосомальной РНК. По результатам секве-нирования домена D1/D2 гена 26S рРНК типовых

1 Адресат для корреспонденции (e-mail: gnaumov@yahoo.com).

культур более чем 600 видов аскомицетовых дрожжей [4, 5] была создана компьютерная база данных, используемая в настоящее время для определения таксономического положения новых штаммов. Для установления филогенетического родства близких видов дополнительно применяют анализ 5.8S-ITS-фрагмента, включающего ген 5.8S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2. Этот район рРНК характеризуется значительной межвидовой дивергенцией и низким уровнем внутривидового полиморфизма. Длина ITS района постоянна у штаммов одного и того же вида [6], но его последовательность может варьировать [7, 8].

Принципиально важную информацию о хромосомном составе геномов дрожжей можно получать с помощью пульс-электрофореза нативных хромосомных ДНК. Этот метод, представляющий своего рода "молекулярную кариологию", широко применяется для исследований в области эволюции и систематики различных дрожжей [9, 10].

В настоящей работе на материале 40 штаммов различного географического и экологического происхождения проведено изучение молекуляр-но-генетических особенностей генома дрожжей Y. lipolytica.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучаемые штаммы и их происхождение приведены в таблице. Дрожжи культивировали при 28°С на полной среде YPD (10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л пептона, 20 г/л глюкозы, 20 г/л агара).

Полимеразную цепную реакцию осуществляли на ДНК-амплификаторе Терцик ("ДНК-Технология",

Россия) непосредственно на дрожжевых клетках с помощью праймеров NL-1 (5'-GCATAT-CAATAAGCGGAGGAAAG), NL-4 (5'-GGTCCGT-GTTTCAAGACGG) для домена D1/D2 и ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG), ITS4 (5'-TCCTC-CGCTTATTGATATGC) для 5^-ПБ-фрагмента. Микробиологической петлей небольшое количество биомассы дрожжей суспендировали в 30 мкл буфера, содержащего 3 мМ MgCl2, 0.3 мМ каждого дНТФ, 50 пмоль каждого из праймеров. Полученную смесь выдерживали при 95°С в течение 15 мин для лизиса клеток, затем добавляли 2.5 единицы Taq-полимеразы ("Синтол", Россия). Для ампли-фикациии района D1/D2 реакцию ПЦР проводили в следующем режиме: начальная денатурация — 1 мин при 94°С, затем 36 циклов: денатурация ДНК — 94°С, 1 мин; отжиг праймеров — 52°С, 1 мин; синтез ДНК — 72°С, 1 мин и конечная достройка — 1 мин при 72°С. Для амплификации 5.8S-ITS-фраг-ментов начальную денатурацию проводили при 94°С в течение 3 мин, затем 30 циклов в следующем режиме: денатурация при 94°С — 30 с, отжиг праймеров при 56°С — 30 с, синтез ДНК при 72°С — 60 с, конечная достройка — 72°С, 10 мин.

Секвенирование и филогенетический анализ. Ам-

плифицированные D1/D2 и 5^-ПБ-фрагменты элюировали из геля с помощью набора GeneClean Kit согласно протоколу фирмы-изготовителя ("Bio 101 Inc.", США). Нуклеотидные последовательности по двум цепям определяли с помощью прямого секвенирования по методу Сенгера на автоматическом секвенаторе "Beckman-Coulter" (США). Поиск гомологии с известными нуклеотидными последовательностями проводили в программе BLAST. Множественное выравнивание полученных и уже известных нуклеотидных последовательностей осуществляли вручную с использованием программы BioEdit. Установление филогенетических родственных связей и построение филогенетического дерева проводили при помощи программы Neighbor-Joining из пакета MEGA 3, используя алгоритм Neighbor-Joining [11]. Индексы бутстрепа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, определяли для 1000 псевдореплик.

ПЦР с неспецифичными праймерами (RAPD-ПЦР). Выделение дрожжевой ДНК проводили по методу, описанному ранее [12]. Амплификацию ДНК с RAPD праймерами 0PA-04 (5'-AATCGGGCTG), 0PA-09 (5'-GGGTAACGCC) и OPA-11 (5'-CAATCGCCGT) проводили в 30 мкл буфера, содержащего 3 мМ MgCl2, 0.3 мМ каждого дНТФ, 50 пмоль каждого праймера, 1.25 ед. акт. Taq-полимеразы ("Синтол", Россия), 20—200 нг анализируемой геномной ДНК. 45 циклов ПЦР осуществляли в режиме: денатурация ДНК — 94°С, 1 мин, отжиг праймера — 36°С, 1 мин, синтез ДНК — 72°С, 2мин.

Происхождение изученных штаммов Yarrowia lipolytica

Коллекционный номер Источник и место выделения

CLIB122 Генетическая линия

CBS 599 Прогорклый маргарин, Нидерланды

CBS 2070 Поврежденная роговица, Италия

CBS 2072 Неизвестно

CBS 2073 Маслины, Италия

CBS 2074 Маслины, Италия

CBS 2075 Прогорклый маргарин, Нидерланды

CBS 2078 Почва, Нидерланды

CBS 2787 Кожа человека, Германия

CBS 5570 Легкие человека, Аргентина

CBS 5589 Легкие человека, Аргентина

CBS 5699 Углеводороды, Франция

CBS 5919 Неизвестно

CBS 6012 Неизвестно

CBS 6114 Неизвестно

CBS 6124 (Т) Завод по переработке кукурузы, США

CBS 6124.1 Моноспоровая культура штамма CBS 6124

CBS 6124.2 Моноспоровая культура штамма CBS 6124

CBS 6125 Кукуруза, США

CBS 6303 Почва, Япония

CBS 6317 Молочный продукт, США

CBS 6614 Сточные воды, Франция

CBS 6659 Почва, Россия

CBS 6660 Почва, Россия

CBS 7033 Почва, Япония

CBS 7034 Почва

CBS 7504 Почва, Франция

ВКПМ Y-2 Болгария

ВКПМ Y-34 Неизвестно

ВКПМ Y-35 Неизвестно

ВКПМ Y-184 Неизвестно

ВКПМ Y-281 Неизвестно

ВКПМ Y-1711 Неизвестно

ВКПМ Y-1712 Нефть

ВКПМ Y-3153 Салат из деликатесов

ВКПМ Y-3154 Почва, Польша

ВКПМ Y-3155 Генетическая линия

ВКПМ Y-3156 Мутант штамма CBS 7504

ВКПМ Y-3157 Генетическая линия

ВКПМ Y-3195 Неизвестно

Примечание. Сокращенные названия коллекций: CBS — Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands, CLIB — Collection de Levure d'Interêt Biotechnologique, Thiverval-Grignon, France, ВКПМ — Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов, Москва. T — типовая культура.

254

НАУМОВА и др.

Амплификацию ДНК с микросателлитными праймерами (ATG)5, (GAC)5, (GTG)5 и минисател-литным праймером М13 (5'-GAGGGTGGCGGT-TCT) проводили в 30 мкл буфера, содержащего 3 мМ MgCl2, 0.3 мМ каждого дНТФ, 30 пмоль каждого праймера, 1.25 ед. акт. 7й#-полимеразы ("Синтол", Россия), 20—200 нг анализируемой геномной ДНК. 40 циклов ПЦР осуществляли в режиме: денатурация ДНК при 94°С — 1 мин, отжиг праймера при 52°С - 2 мин, синтез ДНК при 74°С - 3 мин.

Разделение амплифицированных фрагментов ДНК проводили в 1.2% агарозном геле при 55-60 В в 0.5х ТВЕ буфере в течение 2-3 ч. Гель окрашивали бромистым этидием в течение 1-2 ч, промывали в дистиллированной воде и фотографировали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция).

Пульс-электрофорез хромосомных ДНК и Сау-зерн-гибридизация. Приготовление препаратов хромосомных ДНК описано ранее [12]. Разделение хромосомных ДНК осуществляли на аппарате CHEF-DR III ("Bio-Rad", США). Пульс-электрофорез проводили при 50 В в течение 48 ч при времени переключения полей 40 мин, затем в течение 70 ч при времени переключения полей 50 мин и в течение 22 ч при времени переключения полей 55 мин. В качестве буфера использовать 0.5х TBE, охлажденный до 12°С. Размеры отдельных хромосом дрожжей Y. lipolytica устанавливали с помощью коммерческих стандартов хромосомных ДНК штаммов Saccharomyces cerevisiae YNN 295, Pichia canadensis YB-4662-VIA и Schizosaccharomyces pombe 972 h-, имеющих известные размеры и порядок хромосом. После электрофореза гель окрашивали бромистым этидием в течение 2-3 ч, затем промывали в дистиллированной воде в течение 2 ч и фотографировали в УФ-свете.

Перенос хромосомных ДНК на нитроцеллюлоз-ную мембрану проводили вакуумным способом с помощью аппарата Vacuum blotter ("Bio-Rad", США). ДНК фиксировали на мембране отжигом при 80°С в течени

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком