ГЕНЕТИКА, 2012, том 48, № 4, с. 529-541
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 599.742.4:575.852:575.174.015.3
ИЗМЕНЧИВОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА ДОМЕСТИЦИРОВАННОГО СОБОЛЯ (Martes zibellina)
© 2012 г. Б. В. Андрианов1, С. Ю. Сорокина2, О. Е. Лазебный2, И. И. Горячева1,
Т. В. Горелова1, С. Н. Каштанов1
Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва 119991
e-mail: andrianovb@mail.ru
2Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва 117334
Поступила в редакцию 17.08.2011 г.
Впервые проведен сравнительный анализ митохондриальной изменчивости соболей клеточного разведения и из природных популяций Урала, Центральной Сибири, Якутии, Камчатки и Японии. Для анализа взят фрагмент 5'-области митохондриального контрольного района длиной 427 пн, включающий область Д-петли. Показано разделение митохондриального генофонда соболя на две основные гаплогруппы и идентифицированы вероятные предковые гаплотипы соболя, что дает новые данные для реконструкции процесса заселения соболем современного ареала. Выявлена асимметрия в распределении гаплотипов соболей клеточного разведения по обилию. Идентифицированы митохондриальные гаплотипы, характерные для породного соболя. Обсуждается вероятное участие часто встречающихся в выборке клеточного соболя митохондриальных гаплотипов в адаптации соболя к условиям культуры.
Соболь (Martes zibellina) обитает на обширном ареале в таежной зоне Евразии и образует ряд морфологических типов [1].
В результате изучения молекулярной филогении Mustelidae и рода Martes была показана моно-филетичность семейства Mustelidae и определены гены, подходящие для реконструкции филогенеза в пределах семейства, рода и для изучения внутривидовой популяционной структуры [2]. Порядок филиации в пределах родов Martes и Mustela был установлен на основе анализа изменчивости фрагмента гена цитохромоксидазы b (cytb) [3]. В роде Martes соболь относится к группе молодых видов, сформировавшихся в плейстоцене. Около миллиона лет назад предковый вид соболя разделился на три современных вида: Martes zibellina, Martes martes и эндемичный для Японских островов Martes melampus. Впоследствии филогенез куниц был изучен на гораздо более обширном материале. В работе [2] помимо гена cytb был проведен анализ изменчивости фрагментов еще 21 ядерного гена (общая длина фрагментов около 12000 пн). Проведенный анализ позволил установить филогенетические отношения даль-нородственных видов семейства Mustelidae, но в отношении рода Martes полученная реконструкция точно совпала с результатом [3], полученным при анализе фрагмента гена cytb длиной 402 пн. Удобный для реконструкции филогенеза на уровне рода ген cytb оказался неэффективным при анализе внутривидовой изменчивости. В популяциях соболя Японских островов в гене cytb были
выявлены лишь несколько замещений [4], кроме того получены данные о наличии у Martes zibellina фрагментов гена cytb в ядерном геноме, что может служить источником ошибок [5]. Наиболее информативным оказался анализ последовательности Д-петли митохондриального генома [4]. В настоящее время генетическая структура природных популяций соболя изучена фрагментарно. Анализ изменчивости Д-петли в выборках соболей Урала, Якутии [6] и Японии [7] позволил сделать вывод о слабой выраженности географической подразделенности в популяциях соболя, что указывает на недавнее расселение соболя по нынешнему ареалу. Вероятное время заселения Японских островов оценивается в 16000 лет и связано с окончанием последнего оледенения [7]. Остальные популяции, вероятно, имеют меньший возраст.
Разводить соболя в условиях клеточного содержания в России начали в 1928—1930 гг., позднее, чем большинство других видов пушных зверей. Для разведения соболя были использованы животные, отловленные в Сибири и на Дальнем Востоке. Селекционная работа позволила создать две породы соболя. Хронология создания этих пород соболя описана в сборнике [1].
Порода "Черный соболь" была получена путем жесткого направленного отбора на затемнение окраски меха. В результате было получено стадо с черным окрасом меха, при этом снизился выход щенков на самку. Для породы соболей "Салтыковская-1" характерен темно-коричневый
окрас меха и хорошие показатели воспроизводства. Процесс доместикации соболя не завершен и представляет значительный интерес для молекулярной генетики, прежде всего с точки зрения изучения генетических последствий процесса одомашнивания. В настоящей работе впервые проведено сравнительное изучение митохондри-альной изменчивости соболей из природных популяций и соболей клеточного разведения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Описание выборки соболей
Сборы образцов крови соболей клеточного содержания были проведены в 2006—2009 гг. в звероводческих хозяйствах "Салтыковский" и "Пушкинский". Для сравнения митохондриаль-ной изменчивости доместицированного соболя и соболя из природных популяций были проанализированы все доступные сиквенсы Д-петли соболя из базы данных GenBank. Кроме того, мы дополнительно получили сиквенсы Д-петли у соболей, отловленных в Южной Якутии, на Камчатке и в Приамурье (табл. 1). Всего было получено 133 новых сиквенса от соболей клеточного разведения и 20 сиквенсов от соболей из природных популяций.
Выделение ДНК, проведение ПЦР и секвенирование
Суммарную геномную ДНК выделяли из крови или из фрагментов тканей соболя стандартным фенол-хлороформным методом. ПЦР-амплифи-кацию фрагмента Д-петли проводили с использованием праймеров:
прямой: F-MZ1 CTAACTAAACTATTCCCT-GATTTCC;
обратный: R-MZ2 TGTCCTGTGACCAT-TGACTG.
Праймеры амплифицируют фрагмент Д-петли соболя длиной 538 пн. Центральная часть этого фрагмента длиной 427 пн была выбрана для анализа. В полном митохондриальнм геноме соболя (GenBank № FJ429093.1) этот фрагмент соответствует области с 15486 по 15912 нуклеотид. Выбранный фрагмент полностью перекрывается с фрагментами Д-петли из работ других авторов [6, 7], что позволило включить их данные в анализ, проведенный в настоящем исследовании. Для этого все выбранные нами фрагменты были стандартно обрезаны до размера 427 пн.
Для проведения реакции ПЦР использовали наборы фирмы "Евроген" в условиях, рекомендованных фирмой-производителем. В реакцию амплификации брали по 0.1 мкг тотальной ДНК. ПЦР проводили на амплификаторе Applied Biosystems в следующих условиях: первичная денатурация — 5 мин при 94°С; 35 циклов: денатурация
при 94°С — 30 с, отжиг при 56°С — 30 с, синтез при 72°С — 45 с; завершающий синтез при 72°С — 10 мин. Продукты амплификации разделяли методом электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле.
Биоинформационный анализ
Аннотирование последовательности Д-петли проводили с помощью программы BLAST. Построение филограмм и анализ полиморфизма последовательностей Д-петли в выборках соболей клеточного разведения и из природных популяций проведены в программе MEGA5 [8]. Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществлено методом Clustal-W. Построение фило-граммы Д-петли соболя и родственных видов куниц проведено с помощью NJ алгоритма. Построение медианной сети митохондриальных га-плотипов проведено в программе TCS [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Генетическая карта контрольного района ми-тохондриального генома соболя представлена на рис. 1. В настоящее время известны две неопубликованные полные последовательности мито-хондриального генома соболя (Genbank ID: FJ429093.1 и HM106323.1). Нумерация нуклеоти-дов дана по первой из них. Анализируемый фрагмент Д-петли включает следующие функционально значимые домены: точка терминации репликации Н-нити — TAS-элемент и пять CSB-элементов. Эти элементы определяют правильную терминацию растущей L-цепи митохондриальной ДНК, копийность митохондриальной ДНК и эффективность транскрипции с LSP промотора [10]. Все изменчивые сайты, выявленные в Д-петле соболя, представлены в табл. 2. Изменчивость наблюдается в 5'-области изучаемого фрагмента и затрагивает только два из шести консервативных доменов: TAS-элемент и CSB-F-элемент.
Реконструкция филогенетических отношений гаплотипов соболя и соответствующих последовательностей Д-петли близкородственных куниц представлена на рис. 2. Несмотря на использование сравнительно короткого фрагмента митохон-дриального генома, получено очень хорошее совпадение с известной филогенией рода Martes [2]. У соболя с высокой бутстреп-поддержкой выявляются две гаплогруппы. Формирование этих гаплогрупп произошло, вероятно, еще у общего предка соболя, европейской куницы и японского соболя, как следует из положения точек ветвления на горизонтальной оси. Гаплогруппы четко различаются по четырем филогенетически значимым замещениям. Все гаплотипы первой гаплогруппы объединяют замены С на А в положении 15517 и А на С в положении 15518 (табл. 2). Кроме того, в положении 15513 у гаплотипов первой
427 пн ПЦР-фрагмент
Рис. 1. Генетическая карта контрольного района митохондриальной ДНК соболя и его Д-петли. Контрольный район митохондриального генома позвоночных ограничен генами tRNAPro и tRNAPhe. Сравнительный анализ контрольных районов у млекопитающих позволяет выявить в контрольном районе соболя центральный консервативный домен, фланкированный двумя изменчивыми доменами. Границы консервативных элементов определены согласно [10, 11]. Локализация ориджина репликации для Н-нити митохондриальной ДНК — Он и промоторов для легкой и тяжелой цепей ДНК — LSP и HSP, соответственно, определена относительно расположения консервативных доменов. 5'-из-менчивый домен соболя сравнительно короткий и содержит единственный TAS-элемент (15568—15594), в пределах которого предположительно терминируется синтез L-нити митохондриальной ДНК. В З'-изменчивом домене идентифицированы консенсусные последовательности консервативных блоков — CSB-1 (15983—16006) и CSB-2+3 (1627216288; 16324—16340), где предположительно происходит расщепление транскрипта с LSP промотора и инициация синтеза L-цепи ДНК с формированием триплексной структуры ДНК в районе Д-петли. Консервативные области Д-петли: CSB-F (15624-15653), CSB-E (15665-15701), CSB-D (15723-15748), CS
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.