РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 2, с. 183-190
== РАДИАЦИОННАЯ БИОХИМИЯ =
УДК [57+61]:539.1.047:599.323.45:591.436:577.152.1:57.043:576.311.347
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОСЕКУНДНОГО ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКОГО РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
© 2013 г. И. Р. Князева1, 2*, В. В. Иванов1, М. А. Большаков2, 3, Л. П. Жаркова2, 3, А. В. Керея2, 3, О. П. Кутенков2, В. В. Ростов2
1 Сибирский государственный медицинский университет, Томск 2Институт сильноточной электроники СО РАН, Томск 3 Томский государственный университет
Исследовано влияние импульсно-периодического рентгеновского излучения (ИПРИ) (длительность импульса на полувысоте 4 нс, ускоряющее напряжение 300 кВ, ток электронного пучка 2.5 кА) на активность ферментов антиоксидантной системы митохондрий печени белых мышей. В ходе исследования суспензии митохондрий подвергали однократному воздействию 4 000 рентгеновских импульсов с частотами повторения в диапазоне 10—22 за 1 с, доза в импульсе 0.3—1.8 х 10-6 Гр/имп. в суммарной поглощенной дозе за сеанс облучения до 7.2 х 10-3 Гр. Установлено, что воздействие ИПРИ изменяет активность и соотношение активностей ферментов антиоксидантной защиты. Наибольший эффект наблюдался в изменении активности металлосодержащих ферментов су-пероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы. Эффект зависит от частоты повторения импульсов и дозы излучения.
Наносекундное импульсно-периодическое рентгеновское излучение, митохондрии, антиоксидантные ферменты.
БО1: 10.7868/80869803113010050
Появление источников импульсного рентгеновского излучения, а именно импульсно-перио-дического рентгеновского излучения (ИПРИ), создает необходимость изучения действия данного фактора на живые системы с точки зрения определения характера влияния (стимулирующий или ингибирующий) и механизмов действия. Источники импульсного рентгеновского излучения, работающие в импульсно-периодиче-ском режиме, способны генерировать импульсы с частотой повторения от единиц до сотни герц, длительностью единицы—десятки наносекунд и уровнем поглощенной дозы от 10 мкГр до единиц мГр за импульс [1, 2].
Биологическое действие этих видов излучений гораздо менее изучено в сравнении с непрерывными. Тем не менее к настоящему времени проведен широкий круг исследований, направленных на установление первичных механизмов и общих закономерностей влияния данного фактора на живые объекты. Установлено, что ИПРИ при воз-
* Адресат для корреспонденции: 634050 Томск, Московский тракт, 2, Сибирский государственный медицинский университет; тел.: (3822) 52-93-64; e-mail: knyazeva_irekle@ mail.ru.
действии в относительно низких суммарных дозах оказывает выраженный биологический эффект. Оно способно изменять продолжительность жизни и плодовитость дрозофил [3], инициировать у крыс и мышей изменение морфологических и биохимических показателей крови и печени [4—6], изменять пролиферативную активность клеток [7] и функциональное состояние митохондрий [8, 9]. Существенным оказалось то, что после облучения организма, в частности, организма мышей в печени животных изменяется уровень содержания активных форм кислорода (АФК) [10] и происходит окислительная модификация биополимеров [4, 6].
Одним из возможных источников АФК, в том числе и в гепатоцитах, могут быть митохондрии, в которых, наряду с нормальным четырехвалентным восстановлением кислорода до воды, возможно и одноэлектронное восстановление кислорода с образованием О- [11, 12]. Последний может претерпевать дисмутацию с образованием Н2О2 [13, 14], а также при высоких концентрациях способствует высвобождению железа из желе-зосерных белков, которое при взаимодействии с
Н2О2 образует агрессивный гидроксил-радикал [15-18].
Для контроля над уровнем АФК митохондрии содержат эшелонированную систему антиокси-дантных ферментов и механизмов [19]. В частности, в митохондриях печени эта система включает в себя супероксиддисмутазу (СОД), глутатионпе-роксидазу (ГП) и глутатионредуктазу (ГР). СОД
дисмутирует 0— с образованием Н2О2, который восстанавливается в глутатионпероксидазной реакции до воды. В этой реакции как субстрат используется глутатион, который восстанавливается с помощью ГР. Активация антиоксидантных систем митохондрий может препятствовать избыточной генерации АФК дыхательной цепью и повреждению мембран, белков и других структурных компонентов биоорганелл [19].
По имеющимся литературным данным, неимпульсное (непрерывное) ионизирующее излучение в малых дозах оказывает влияние на активность ферментов антиоксидантной защиты [20, 21]. В то же время влияние импульсно-периоди-ческого рентгеновского излучения на состояние систем антиоксидантной защиты митохондрий не изучено. Исходя из этого, цель работы — сравнительное исследование активности антиокси-дантных ферментов в изолированных митохондриях печени мышей после воздействия ИПРИ в различных дозах и при разной частоте повторения импульсов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Характеристика экспериментального объекта. Эксперименты проведены на изолированных митохондриях из печени 144 беспородных белых мышей-самцов массой 25—30 г разводки питомника НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск). Животных содержали в стандартных условиях при постоянной температуре и влажности, в условиях светового режима 12 ч : 12 ч, не более чем по 10 мышей в клетке. Доступ к стандартному гранулированному корму и воде у животных был неограниченным. Перед проведением каждого эксперимента животные находились под наблюдением (в карантине) в течение не менее 14 сут. После окончания карантина мышей распределяли на группы методом случайного отбора, больных и ослабленных животных в эксперимент не брали. Опыты проводили в одно и то же время суток (в утренние часы). При проведении исследований выполнялись требования нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы с использованием животных, в том числе по гуманному обращению с ними: "Этический кодекс" (1985), включающий раздел "Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием жи-
вотных", а также основываясь на положениях Хельсинской Декларации Всемирной Медицинской Ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.
Выделение митохондрий из печени мышей. Для получения изолированных митохондрий из гепа-тоцитов мышей использовали модифицированную методику [22]. Каждую экспериментальную пробу суспензии митохондрий выделяли из целой печени. Все манипуляции, связанные с забором материала и выделением субклеточных фракций, проводились при температуре от 0 до +4°С. Печень освобождали от крови путем перфузии insitu, охлажденной до 0°С, средой выделения, содержащей 0.3 моль/л раствор сахарозы, 1 ммоль/л раствор ЭДТА, 10 ммоль/л Трис-буфер, pH 7.4. Ткань гомогенизировали в 15 мл среды выделения в течение 30—40 с и гомогенат центрифугировали на рефрижераторной центрифуге "ЦРЛ-1" 5 мин при 5 000 g при 0...+2°С. Надоса-дочную жидкость использовали для выделения митохондриальной фракции путем центрифугирования 5 мин при 10000 g. Осадок митохондрий тщательно ресуспендировали в среде, содержащей 0.3 моль/л раствора сахарозы и 20 ммоль/л Трис-буфера (рН 7.4). Готовая суспензия митохондрий на протяжении всего эксперимента находилась на льду.
Облучение суспензии митохондрий ИПРИ. Полученные суспензии митохондрий были разделены на 24 группы (по 12 в контроле и опыте). Для каждого из режимов воздействия объем выборки составлял не менее 6 проб. Опытные группы суспензий митохондрий подвергали однократному воздействию 4 000 рентгеновских импульсов с разными параметрами: в дозах 0.3, 1.1 и 1.8 х 10-6 Гр/имп. и с частотами повторения 10, 13, 16 и 22 имп./с. Для каждой облученной группы в качестве контроля использовали ложнооблученные (ЛО) суспензии митохондрий, которые подвергали аналогичным манипуляциям, что и облученные, но без включения источников излучения. Длительность воздействия варьировала от 3 до 7 мин в зависимости от частоты повторения импульсов.
В качестве источника ИПРИ использовали тормозное излучение ускорителя "Синус-150" (Россия, длительность импульса на полувысоте 4 нс, ускоряющее напряжение 300 кВ, ток электронного пучка 2.5 кА, энергия фотонов с максимумом 100 кэВ, частота повторения до 100 имп./с) [1]. При использованных частотах повторения импульсов и импульсных дозах суммарная поглощенная доза за сеанс облучения (4 000 импульсов) составляла 1.2—7.2 х 10-3 Гр. Измерение поглощенной дозы производили с помощью термолюминесцентных LiF-детекторов в комплекте метрологически поверенного дозиметра "КДМ-02М", а оперативный контроль осуществляли с помо-
щью электростатических дозиметров с кварцевым волокном "Arrow-Tech 138" ("Arrow-Tech, Inc", США) и постоянной регистрацией импульсов ускоряющего напряжения.
Для выделения исследуемых ферментов облученные митохондрии разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора клеток "Ultrasonic Cell distruptor - модель XL 205" ("Heat Systems", USA) трижды по 10 с. Гомогенат митохондрий центрифугировали с ускорением 20000 g 30 мин при 4°С. В надосадочной жидкости определяли концентрацию белка по методу [23] и активность антиоксидантных ферментов.
Определение активности антиоксидантных ферментов в изолированных митохондриях мышей. Активность супероксиддисмуьтазы (СОД) (КФ 1.15.1.1) определяли по методу [24]. В качестве положительного контроля использовали коммерческий препарат СОД ("Sigma"), с помощью которого была построена калибровочная кривая. Активность фермента выражали в Ед/мг белка митохондрий.
Определение активности глутатионперокси-дазы (ГП) (КФ 1.11.1.9) в изолированных митохондриях печени мышей проводили по методу [25]. Активность фермента выражали в нмоль НАДФН-окисленного в минуту на 1 мг белка митохондрий [26].
Активность глутатионредуктазы (ГР) (КФ 1.6.4.2) определяли высокочувствительным спек-трофотометрическим методом [27]. Активность фермента выражали в нмоль/мин/мг белка митохондрий, принимая коэффициент молярной экс-тинции для 5-тио(2 нитро) бензойной кислоты равным 14.15 ммоль-1 • см-1. В качестве
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.