ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 686-691
УДК 581.132
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ЛИСТЬЯХ И КОРНЯХ ПШЕНИЦЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФОРМЫ
И ДОЗЫ АЗОТА В СРЕДЕ
© 2004 г. О. Г. Полесская, Е. И. Каширина, Н. Д. Алехина
Кафедра физиологии растений биологического факультета Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 15.09.2003 г.
Определяли активность ферментов, включенных в систему антиоксидантной защиты, во втором листе и корнях 21-дневных проростков пшеницы (ТгШеит aestivum Ь.), росшей на средах с нитратом
(МО- -вариант), аммонием (МН+ -вариант) и без азота (]-дефицитный вариант). В тканях листа и
корня МН+ -растений активность супероксиддисмутазы (СОД), пероксидазы, аскорбатпероксидазы,
глутатионредуктазы и каталазы была значительно выше, чем у растений, выросших на нитрате. У ]]-дефицитных растений по сравнению с нитратным и аммонийным вариантами в листе существенно увеличивалась активность СОД и аскорбатпероксидазы, а в корнях - активность аскорбатпероксидазы. Инкубация при низкой температуре (5°С, 12 ч) по-разному влияла на антиоксидантную
активность исследуемых растений. Если в листе мн; -растений изменений в активности ферментов
не наблюдалось, то в листе МО3 -растений активность СОД, пероксидазы, аскорбатпероксидазы и каталазы заметно возрастала. У ]-дефицитных растений в листе падала активность СОД, но активность остальных ферментов увеличивалась. В корнях МО3 -, и МН+ -растений в ответ на понижение температуры увеличивалась активность каталазы, тогда как у ]-дефицитных растений снижалась активность пероксидазы. Таким образом, у пшеницы как форма азота, так и недостаток этого элемента влияли на активность и "поведение" ферментов-антиоксидантов в ответ на действие низкой температуры.
ТгШеит aestivum - азотное питание - супероксиддисмутаза - пероксидаза - аскорбатпероксидаза -глутатионредуктаза - каталаза
В клетках растений в ходе разнообразных процессов образуются активные формы кислорода (АФК) - синглетный кислород (О*), супероксид-
радикал (О2) и перекись водорода (Н2О2). Все эти соединения способны реагировать с липидами, белками и ДНК, повреждая структуру мембран и макромолекул.
В клетке существует динамическое равновесие между образованием АФК и их ликвидацией. Важнейшие антиоксиданты растений - каротино-иды, их взаимодействие с возбужденным светом
Сокращения: СОД - супероксиддисмутаза; АФК - активные формы кислорода.
Адрес для корреспонденции: Полесская Ольга Генриховна. 119899 Москва. Воробьевы горы. Московский государственный университет, биологический факультет, кафедра физиологии растений. Факс: 007 (095) 939-43-09; электронная почта: plantphys@biophys.msu.ru
хлорофиллом препятствует генерации О* [1]. Образование (О2) происходит в ФС I в хлоропластах и на комплексах дыхательной цепи в митохондриях, а также в ряде реакций, протекающих в пе-
роксисомах [1-6]. Нейтрализация О2 при участии супероксиддисмутазы (СОД) приводит к образованию Н2О2 [1, 4, 6]. В ликвидации последней участвуют несколько ферментов: каталаза, пероксидазы и ферменты, включенные в аскорбат-глутатио-новый цикл. В этом цикле аскорбатпероксидаза восстанавливает Н2О2 до воды, окисляя аскорбат до дегидроаскорбата. Последний вновь восстанавливается до аскорбата за счет восстановленного глутатиона. Глутатионредуктаза катализирует -восстановление окисленного глутатиона за счет НАДФН [1, 2, 4]. При стрессах разной природы образование АФК в клетках растений усиливается, что в итоге может привести к окислительному стрессу [3, 6]. В то же время перекись является
вторичным мессенджером в сигнальном каскаде, включающим индукцию синтеза ферментов-ан-тиоксидантов [3, 5]. Полагают, что уровень их активности и способность к ее быстрому увеличению определяют устойчивость растений к действию стресса [6-14].
Изменения в активности ферментов-антиокси-дантов наблюдали в ответ на засуху [7-9], засоление [10-11], действие низкой температуры [12-13], повышение концентрации цинка в среде [14] и т.д. Известна одна работа, в которой показано, что в листьях кофе реакция СОД и аскобатпероксида-зы на высокую интенсивность света зависела от дозы азота, которую получало растение [15]. Однако в целом в литературе мы не встретили работ, в которых состояние антиоксидантной системы рассматривалась бы в зависимости от снабжения растений азотом. В то же время хорошо известно, что именно условия азотного питания оказывают всестороннее влияние на растительный организм. Наличие или отсутствие азота, использование нитрата или аммония определяют характер роста растения [16-18], внутриклеточный рН [19], катионно-анионный состав тканей [20], содержание белка, органических кислот и углеводов [16, 18, 21], активность ферментов, включенных в ассимиляцию азота и синтез органических кислот [21-23].
Ранее мы показали, что акклимация пшеницы к условиям нитратного или аммонийного питания, а также к недостатку азота в среде (N03 -вариант, КИ+ -вариант и К-дефицитный вариант) приводила к формированию разных фенотипов. Изменения затрагивали рост растений, морфологию органов и клеток, содержание белка и углеводов в тканях листа и корня, интенсивность дыхания и фотосинтеза [24-26].
Цель данной работы - выяснить, активизируется ли при такой серьезной перестройке метаболизма под действием "азотного фактора" антиок-сидантная система растений. В задачу работы входило определить активность ключевых фер-ментов-антиоксидантов в листьях и корнях и сравнить реакцию антиоксидантной системы на кратковременное понижение температуры у трех вариантов пшеницы.
МЕТОДИКА
Пшеницу (ТгШсит aestivum Ь., сорт Инна) выращивали, как описано ранее [24], при разном
азотном питании: N0- -вариант - на смеси Хог-
ланда (1/5 нормы, N03 - 3 мМ); К-дефицитный вариант - также на смеси Хогланда (1/5 нормы), в которой соли нитрата замещали эквимолярным
по катионам количеством KCl и CaSO4; NH+ -вариант - на модифицированной смеси Прянишникова, содержащей NH4Cl (3 мМ). Питательный раствор меняли каждые три дня, рН среды поддерживали на уровне 6.8. Растения выращивали при интенсивности света 100 В/м2, фотопериоде l6/8 ч (день/ночь) и температуре 25°/20°С. При изучении действия низкой температуры растения выдерживали 12 ч в темноте при температуре 5°С. Объектом исследования были корни и второй, полностью сформированный лист 21-дневных растений, не проявляющий признаков старения [25].
Для получения ферментативного экстракта навеску растительного материала (0.5 г) растирали с песком в ступке в 10-25 мл охлажденного 60 мМ K-Na-фосфатного буфера (рН 7.2), содержащего 0.1 мМ ЭДТА. Гомогенат фильтровали через полотно и центрифугировали 20 мин при 12000 g при 4°С. Супернатант использовали для определения активности ферментов.
Общую активность СОД (ЕС 1.15.1.1) определяли по способности фермента ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тет-разолия, согласно [27]. Реакционная смесь (3 мл) содержала: K-Na-фосфатный буфер (60 мМ, рН 7.8), метионин (13 мМ), рибофлавин (2 мкМ), (р-)нит-росиний тетразолий ("ICN", США) (63 мкМ), ЭДТА (0.1мМ) и 100 мкл ферментной вытяжки. Реакция проходила в течение 10 мин при освещении 15 В флуоресцентными лампами. Полная реакционная среда, инкубированная в темноте, служила темно-вым контролем. Полная реакционная среда без фермента, в которой на свету развивалась максимальная окраска, служила световым контролем. Реакцию прерывали выключением света, помещая пробы в темноту. Оптическую плотность определяли при 560 нм. За единицу активности СОД принимали количество фермента, способного подавить реакцию восстановления нитросинего тет-разолия на 50%. Активность СОД выражали в условных единицах в расчете на 1 г сырой массы.
Об активности гваякол-специфичной перокси-дазы (ЕС 1.11.1.7.) судили по увеличению оптической плотности при 470 нм в результате окисления гваякола (E = 26.6 мМ-1 см1) в присутствии перекиси, согласно [14]. Реакционная среда (3 мл) содержала: K-Na-фосфатный буфер (60 мМ, рН 6.1), 1%-ный гваякол ("Sigma", США), Н2О2 (10 мМ) и 100 мкл вытяжки. Реакция начиналась при добавлении перекиси. Оптическую плотность измеряли в течение 5 мин с интервалом 20 с. Активность фермента рассчитывали в мкмолях окисленного гваякола на 1 г сырой массы в минуту.
Активность глутатионредуктазы (ЕС 1.6.4.2.) определяли, согласно [14], по уменьшению оптической плотности при 340 нм в результате окисления НАДФН (E = 6.2 мМ-1 см1) в присутствии
Таблица 1. Содержание пигментов во втором листе растений пшеницы в зависимости от формы азота в питательной среде (мг/г сырой массы)
Содержание пигментов NO- -вариант NH+ -вариант N-дефицитный вариант
Хлорофиллы (a + b) 1.91 ± 0.03 2.46 ± 0.08 1.88 ± 0.03
Каротиноиды 0.44 ± 0.03 0.58 ± 0.02 0.44 ± 0.04
Хлорофиллы/каротиноиды 4.28 ± 0.32 4.25 ± 0.22 4.28 ± 0.31
окисленного глутатиона. Реакционная среда (3 мл) содержала: K-Na-фосфатный буфер (60 мМ, рН 7.8); окисленный глутатион (0.5 мМ), НАДФН (0.12 мМ) и 50-100 мкл экстракта. Реакция начиналась при внесении фермента. Измерение оптической плотности проводили в течение 10 мин с интервалом 30 с. При измерениях учитывали окисление НАДФ-Н, не связанное с глутатионре-дуктазой. Активность фермента рассчитывали в мкмолях окисленного НАДФ-Н на 1 г сырой массы в минуту.
Активность аскорбатпероксидазы (EC 1.11.1.11) определяли по уменьшению оптической плотности при 290 нм в результате окисления аскорбиновой кислоты (E = 2.8 мМ-1 см1) в присутствии перекиси, согласно [28]. Реакционная среда (3 мл) содержала: K-Na-фосфатный буфер (60 мМ, рН 7.0), аскорбиновую кислоту (250 мкМ), ЭДТА (0.1 мМ), Н2О2 (1.5 мМ) и 100 мкл экстракта. Реакция начиналась при добавлении перекиси. Измерение оптической плотности проводили в течение 5 мин с интервалом 20 с. Активность фермента рассчитывали в мкмолях окисленного аскорбата на 1 г сырой массы в минуту.
Активность каталазы (EC 1.11.1.6) определяли полярографически с использованием кислородного электрода Кларка [14]. Реакционная среда содержала: K-Na-фосфатный буфер (60 мМ, рН 7.0) и 10 м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.