ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 1, с. 121-125
УДК 581.1
ИЗМЕНЕНИЕ БАЛАНСА ФИТОГОРМОНОВ В СТЕБЛЯХ И КОРНЯХ ГОРОХА ПОСЛЕ ДЕКАПИТАЦИИ ПРОРОСТКОВ
© 2004 г. Л. М. Котова, А. А. Котов, А. Н. Кара
Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 02.07.2002 г.
Эксперименты проводили с первым и вторым междоузлиями и 4-сантиметровыми апикальными концами главных корней проростков гороха Pisum sativum L., выращенных на свету и декапитиро-ванных в области третьего междоузлия на 7-й день после прорастания семян. Эндогенные фитогор-моны определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа в течение трех дней после декапитации проростков. В междоузлиях через день после декапитации проростков в 2-3 раза снижался уровень ИУК, и увеличивался уровень цитокининов: зеатина и зеатинрибозида (3 и ЗР) -в 5-6 раз, изопентиниладенина и изопентениладенозина (ИП и ИПА) - в 1.5-2 раза. В корнях дека-питированных проростков, в отличие от междоузлий, декапитация не повлияла на содержание ИП и ИПА, но вызывала 1.5-2-кратное увеличение содержания 3 и ЗР по сравнению с интактными растениями. Уровень ИУК в апикальном участке корня практически не уменьшался в ответ на удаление верхушки побега. Сделан вывод, что апикальная меристема главного корня проростка не является местом цитокининового ответа на ауксиновый сигнал, поступающий из верхушки побега, и что небольшое постдекапитационное накопление 3 и ЗР идет за счет вышележащих зон корня. Разницы в содержании ГК-подобных веществ между междоузлиями интактных и декапитированных проростков не было обнаружено, однако после декапитации верхушки проростка снижалось содержание ГК в кончике корня, что предполагает значимую роль верхушечной почки в снабжении корня ГК и/или интермедиатами для их биосинтеза.
Pisum sativum - апикальное доминирование - фитогормоны - ИУК - цитокинины - АБК - гиббе-реллины
Одним из механизмов интеграции роста частей растений в онтогенезе является синтез и транспорт ростовых регуляторов - фитогормонов, причем ауксин-цитокининовым взаимодействиям и балансу этих гормонов принадлежит ведущая роль [1, с. 192]. Ярким проявлением значимости сдвига ауксин-цитокининового баланса являются последствия декапитации растения: после удаления растущей верхушечной почки - источника ИУК, транспортирующейся из нее базипетально по стеблю в корень, - происходит пробуждение боковых почек. Очевидным и предсказуемым фактом является резкое снижение уровня ИУК в стеблях, на которых пробуждаются почки [2, 3]. При этом отмечается резкое увеличение уровня цитокининов, что было показано при изучении содержания зеатинрибозида (ЗР) и зеатина (3) в
Сокращения: 3 - зеатин; ЗР - зеатинрибозид; ИП - изопен-
тениладенин; ИПА - изопентениладенозин.
Адрес для корреспонденции: Котова Людмила Михайловна.
127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии
растений РАН. Факс: 07(095) 977-80-18; электронная почта:
ifr@ippras.ru
тканях стебля проростков гороха [3, 4], в ксилем-ном эксудате проростков фасоли [5], а также во флоэмном соке проростков гороха [3]. Вероятной причиной повышения уровня цитокининов в де-капитированном побеге является увеличение их притока по ксилеме из корня в ответ на снижение потока ИУК в него.
Физиолого-биохимические аспекты влияния ИУК на уровень цитокининов в корне и транспорт цитокининов из него до сих пор не ясны: снижение содержания цитокининов под действием ИУК может происходить как на уровне ингиби-рования их биосинтеза, так и вызываться их метаболической инактивацией путем К-глюкозилиро-вания, а также деградацией при помощи цитоки-ниноксидаз [6].
Для того, чтобы изучить характер ауксин-ци-токининового взаимодействия, возникла необходимость уточнения места локализации в корне ответа на декапитацию растения. Мы выбрали апикальную часть главного корня, включающую меристему как наиболее вероятную мишень верхушечного ауксина. По литературным данным корневая меристема считается одним из основ-
ных мест синтеза цитокининов [7], необходимых для нормального роста и развития надземных органов растения [8]. Помимо изучения постдекапи-тационного ауксин-цитокининового баланса в стеблях и корнях мы определили также содержание в них ГК и АБК, влияние декапитации на уровень которых мало исследовано [9].
МЕТОДИКА
Семена гороха (Pisum sativum L., сорт Ульяновский 68) стерилизовали диэтиловым эфиром в течение 1 мин и проращивали в кюветах на влажной фильтровальной бумаге в течение 3 сут в термостате при 27°С. Далее проростки культивировали на водопроводной воде при 15 ± 0.5°С и 14-часовом дне с уровнем освещенности 10 клк в климатической установке на основе холодильной камеры Grünland ("VEB Kühlmöbelwerk Erfurt", Германия). Растения декапитировали отрезанием верхушки в области третьего междоузлия на 7-й день. На первый, второй и третий день после декапитации отчленяли первое и второе междоузлия, а также 4-сантиметровую апикальную часть (состоящую из меристематической зоны и зоны растяжения, лишенную корневых волосков) главного корня, достигающего к этому времени длины 10-12 см. Анализ фитогормонов проводили в 3 биологических повторностях, используя по 9 растений в каждой.
Междоузлия и корни быстро взвешивали, фиксировали и хранили в жидком азоте. Пробы (0.1-0.5 г сырой массы) растирали в жидком азоте и экстрагировали при 4°С 20 ч при постоянном встряхивании на шейкере Sumal 411 ("VEB MLW Prüfgeräte-Werk Medingen Sitz Freital", Германия) в 5 мл 80%-ного метанола, содержащего антиокси-данты: бутилированный гидрокситолуол (200 мг/л, "Sigma", США) и аскорбиновую кислоту (100 мг/л). Экстракты очищали от липидов и хлорофиллов, пропуская через колонку с Поролас ТМ ("ОмскХимПром", Россия). Очищенный мета-нольный экстракт упаривали под током газообразного N2 при 40°С при красном свете. Полученный водный остаток хранили при -20°С до разделения фитогормонов.
Очистку и разделение фитогормонов проводили с помощью жидкостной хроматографии на колонках с поливинилполипирролидоном ("Sigma") и С18 Amprep ("Amersham", Англия). Подробное описание схемы разделения приведено в работе [3]. Получали отдельные фракции, содержащие ПУК, 3 и ЗР, ГКЬ изопентениладенин (ИП) и изопентениладенозин (ППА) и АБК. ГКгсодержащие фракции метилировали. До им-муноферментного анализа очищенные пробы хранили при -20°С.
Выход экзогенных стандартов при данной схеме очистки составлял для ПУК - 88%, ЗР - 85%, 3 - 95%, ППА - 84%, ГКХ - 85% и АБК - 99% (все стандарты фирмы "Sigma"). При дальнейших расчетах потери эндогенных фитогормонов, в связи с их незначительной величиной, не учитывались. Данные по содержанию фитогормонов представлены в пмоль на г сырой массы.
Для определения фитогормонов использовали антисыворотки, которые получали иммунизацией кроликов конъюгатами гормон-белок, приготовленными на основе бычьего сывороточного альбумина [3]. Антисыворотка против ППА была любезно предоставлена к.б.н. Н.В. Катаевой (ПФР РАН, Москва). В качестве конкурентного антигена использовали конъюгаты гормон-белок, синтезированные аналогичными способами на основе овальбумина или овальбумина, модифицированного лизином [3]. Применяли метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с конкурентным ингибированием гормоном из анализируемой пробы связывания первичных гормон-специфических кроличьих антител с гормон-белковым конъюгатом, иммобилизованным на поверхности 96-луночных плоскодонных полистироловых планшет ("Dynatech", США). На втором эпапе выявляли этот комплекс с помощью вторичных антикроличьих антител, меченных пероксидазой хрена (НППЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), по схеме, изложенной в работе [10]. Пнтенсивность хромофорного ответа измеряли при 492 нм на ридере Multiskan MCC-340 ("Titertek", Нидерланды-Финляндия).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Содержание ПУК в стеблях гороха после декапитации проростков, как и следовало ожидать, резко уменьшалось: в верхнем, втором междоузлии - в 2.5-3 раза, в нижнем, первом - в 2-2.5 раза (рис. 1). Содержание ПУК в апикальных 4-сантиметровых отрезках корней в ответ на декапита-цию проростков не менялось, но постепенно снижалось в течение трех суток эксперимента как у интактных, так и декапитированных растений.
Если содержание ПУК в стеблях и корнях проростков было сопоставимо, то содержание цитокининов, как 3 + ЗР (рис. 2), так и ПП + ППА (рис. 3), в отрезках корней было на порядок меньше, чем в междоузлиях (рис. 2 и 3, см. шкалу слева для междоузлий и справа - для корней). Во фракциях 3 + ЗР превалирующим цитокинином был ЗР, во фракциях ПП + ППА - ППА.
Пзучение содержания АБК, которой в корнях на порядок меньше, чем в междоузлиях (так же, как и цитокининов), выявило ее снижение после декапитации проростков (рис. 4). В верхнем, втором междоузлии уменьшение содержания АБК
S3
о св
«
О &
о
200
150
я ч о
«
S
«
s к
се
&
о и о О
100
50
междоузлие 2
2
I
междоузлие 1 к°рень
I
1 2 3
1 2 3
1 2 3
Время после декапитации, сут
б
с а м
«
о р
3
с
я
л о м п
я
к
m
30
20
Рч 00 10 е и
к
а
*
р
е
о
о
междоузлие 2 1
корень
междоузлие 1
1 2 3
1 2 3
1 2 3
Время после декапитации, сут
б
с а
«
о р
3
с
я
л о
я
к
m ■
1 со
е и
к
а
*
р
е д
о
о
Рис. 1. Содержание ИУК в стеблях и корнях декапи-тированных (1) и интактных (2) проростков гороха. Приведены средние из 3 повторностей (по 9 растений в каждой) и их стандартные ошибки.
б
с а
«
о
3 15
с
я
л о
корень
10
я
к
m
I
<
С
S
е и
к
а
*
р
е д
о
О
междоузлие 2 1
междоузлие 1
б
с а
«
о р
1.5 3
с
1.0
12 3 12 3
1 2 3
я
к
m ■
<
С
°.5 ?
и
к
а
*
р
е
0 оде
О
Время после декапитации, сут
Рис. 3. Содержание изопентениладенина и изопенте-ниладенозина в стеблях и корнях декапитированных (1) и интактных (2) проростков гороха. Слева дана шкала для междоузлий, справа - для корней. Приведены средние из 3 повторностей (по 9 растений в каждой) и их стандартные ошибки.
Рис. 2. Содержание зеатина и зеатинрибозида в стеблях и корнях декапитированных (1) и интактных (2) проростков гороха.
Слева дана шкала для междоузл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.