ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 584-595
УДК 574.2+581.132+581.174.1
ИЗМЕНЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА, СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ХЛОРОПЛАСТОВ В ЛИСТЬЯХ ГОРОХА ПРИ ДЕФИЦИТЕ
ЖЕЛЕЗА И АНАЭРОБИОЗЕ КОРНЕЙ
© 2004 г. В. Г. Ладыгин
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290;
e-mail: ladygin@issp.serpukhov.su Поступила в редакцию 14.11.2003 г.
Установлено, что при дефиците железа хлороз верхушечных листьев обусловлен редукцией свето-собирающих комплексов I и II. В условиях анаэробиоза корней в первую очередь нарушаются комплексы реакционных центров ФС-I и ФС-II. При совместном действии двух факторов даже у желтых и белых листьев сохраняется слабая функциональная активность. Ультраструктура хлоропла-стов листьев постепенно разрушается. Вначале редуцируются межгранные участки тилакоидов и нарушается продольная ориентация гран, но у желтых и белых листьев сохраняются небольшие ти-лакоиды и мелкие граны. Делается вывод, что в силу автономных механизмов действия дефицита железа и анаэробиоза корней на состав комплексов, структуру и функционирование хлоропластов листьев их деструктивные эффекты суммируются.
При интенсивном земледелии факторы оптимизации минерального питания и условий культивирования играют решающую роль в получении высоких и устойчивых урожаев. К широко распространенным и трудно регулируемым факторам среды, ухудшающим рост и развитие растений, относятся недостаток кислорода (гипоксия) или его отсутствие (аноксия) в зоне корневой системы, а также дефицит или недоступность железа для усвоения растениями, характерная для карбонатных почв. Оба фактора имеют место при обильном орошении карбонатных почв, когда щелочные рН обусловливают образование трудно растворимых комплексов железа, а избыточный полив создает анаэробиоз корней. Дефицит кислорода в почве возникает как в сельскохозяйственных посевах, так и в естественных условиях обитания растений в результате заболоченности почв, обилия осадков, образования корки льда в весенний период, паводков, а также в оранжереях в условиях гидропоники. Поэтому изучение нарушений метаболизма и механизмов адаптации растений к условиям анаэробиоза корней и дефицита железа имеют как теоретическое, так и прикладное значение.
Работ, посвященных изучению структуры и функции хлоропластов листьев в условиях анаэробиоза корней, очень мало [1, 2], а исследований по влиянию совместного действия дефицита железа и анаэробиоза корней, практически нет [3].
Мы изучили влияние анаэробиоза корней на фотосинтетический аппарат листьев растений в оптимальных условиях питания и при дефиците железа. Известно, что железо играет важную роль в метаболизме листьев [4, 5]. Потребность
растений в железе максимальная, в сравнении с другими металлами, благодаря чему его часто относят к макроэлементам питания. В клетках растений 60-80% железа локализуется в хлороплас-тах [5], оно входит в состав активных центров ферментов и участвует во многих окислительно-восстановительных реакциях [4, 5]. Перечисленные факты позволяют нам надеяться на получение важной и более полной информации о нарушении метаболизма и механизмов адаптации в листьях нормальных и железодефицитных растений в условиях анаэробиоза корней.
В настоящее время влияние анаэробиоза корней хорошо изучено для процессов, протекающих в корневой системе [6-8]. Экспериментальных исследований по совместному действию анаэробиоза корней и дефицита железа на хлоропласты листьев растений до сих пор практически не проводилось.
Остается неясным, каковы будут эффекты при одновременном действии этих факторов и природа их взаимодействия на уровне фотосинтетического аппарата листьев. Важность такого исследования вытекает из неопределенности ожидаемых эффектов, поскольку корневая аноксия не проявляет специфического действия на уровне хлоропластов листьев [2], а дефицит железа, напротив, специфически действует на биохимический состав, структуру и функцию хлоропластов листьев в силу преимущественной локализации ионов железа в фотосинтетических мембранах [4, 5].
Цель работы - изучение влияния дефицита железа и анаэробиоза корней на биохимический состав комплексов фотосистем, функционирование и структуру мембран хлоропластов листьев гороха.
МЕТОДИКА
Объект и условия культивирования. Эксперименты проводили на листьях гороха (Pisum sativum L.), сорта "Превосходный", выращенного в климатической камере ШКВ-I (Россия) в водной культуре на полной среде Арнона [4] (контроль) и на той же среде, но без добавления солей железа (дефицит железа). Для роста контрольных и же-лезодефицитных растений брали по шесть 5 литровых сосудов из винипласта, высаживали по 20 проростков и культивировали в течение 20 сут. Все сосуды продували воздухом в автоматическом режиме по 15 мин каждые 2 ч. Растения росли при 14 часовом фотопериоде на свету 80 Вт/м2 при 25°C днем и 20°C ночью. После 20 сут роста брали по три сосуда контрольных и железодефи-цитных растений, продували среду 10-12 ч аргоном, а затем заливали поверхность водной питательной среды вазелиновым маслом толщиной 23 мм (анаэробиоз корней). Через 3 сут в области корневой системы содержание O2 снижалось практически до нуля [2]. Аналогичным образом создавали корневую аноксию для трех сосудов железодефицитных растений (дефицит железа плюс анаэробиоз корней). В условиях аэрации или анаэробиоза корней растения продолжали расти еще в течение 8-10 сут. Для экспериментов использовали листья 5-7 ярусов с 28-30 суточных растений.
Определение пигментов. Содержание пигментов в листьях определяли спектрофотометричес-ки в 100%-ном ацетоне [9].
Гель-электрофорез. Хлорофилл-белковые комплексы хлоропластов листьев исследовали модифицированным способом гель-электрофореза [10]. Методика получения мембран хлоропластов, обработка их детергентом (0.5%-ный ДДС-Na), а также условия электрофореза описаны ранее [4, 10].
Флуоресценция. Спектры излучения флуоресценции хлорофилла листьев регистрировали в жидком азоте (-196°C) на установке, собранной на основе двух монохроматоров [11, 12]. Флуоресценцию возбуждали синим светом при 436 или 480 нм и регистрировали в области 650-800 нм [13].
Спектральные формы хлорофилла. Формы хлорофилла анализировали по низкотемпературным спектрам поглощения хлорофилла листьев и их вторым производным, которые регистрировали в жидком азоте (-196°C) с помощью двухлуче-вого и двухволнового спектрофотометра Hitachi-356 (Япония) с приставкой, описанной ранее [14].
Фотосинтез и темновое дыхание. Интенсивность фотосинтеза и темнового дыхания листьев определяли амперометрическим методом на по-лярографе по кинетике выделения и поглощения O2, измеренному с помощью электрода Кларка.
Фотохимическая активность хлоропластов. Активность ФС-I и ФС-II измеряли по сигналам
ЭПР I и ЭПР II, используя формулы, описанные ранее [15, 16]. Отношением числа молекул хлорофилла в образце к числу реакционных центров ФС-1 или ФС-П характеризовали величину светосо-бирающей антенны. Число реакционных центров определяли по величине светоиндуцированных сигналов ЭПР I и ЭПР II, соответствующих числу парамагнитных центров П700 (П+00) ФС-Г и пластосеми-хинона [15] или тиразина Б1- и Б2- белков [17] ФС-П.
Электронная микроскопия хлоропластов.
Структурную организацию тилакоидов хлоропластов анализировали на срезах листьев. Методика фиксации, обезвоживания, получения срезов и просмотр образцов с помощью электронного микроскопа описана ранее [4].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Содержание пигментов. Исследования контрольных и опытных растений показали, что вплоть до образования листьев 4 яруса железоде-фицитные растения практически не отличались по скорости роста и содержанию пигментов от контрольных. В дальнейшем при формировании листьев 5-7 ярусов рост опытных растений замедлялся, но число ярусов во всех вариантах было практически одинаковым. Вероятно, на первых этапах роста растений листья медленно реагировали на отсутствие железа в питательной среде, благодаря наличию больших пулов неметаболи-зирующих форм железа, локализованных в хло-ропластах, главным образом, в виде фитоферри-тина [18]. Однако, когда эти пулы истощались, наблюдалось очень быстрое развитие хлороза верхушечных листьев [19-22].
Исследование содержания пигментов показало, что листья 5 яруса железодефицитных растений, хотя и оставались зелеными, но уже накапливали лишь 60-70% хлорофилла от содержания его в аналогичных листьях контрольных растений (табл. 1). Листья 6 яруса становились светло-зелеными и содержали 25-35%, а 7 яруса - желтыми и накапливали лишь 10-15% хлорофилла, по сравнению с контрольными. Листья 8 яруса были практически белыми и накапливали менее 1% хлорофилла. По содержанию пигментов листья 5-8 ярусов контрольных растений практически не отличались между собой.
Содержание пигментов в листьях 5-7 ярусов при совместном действии двух факторов было на 5-15% ниже, чем только при дефиците железа (табл. 1). Следовательно, хотя анаэробиоз корневой системы сам по себе мало влиял на накопление пигментов в листьях гороха [1, 2], тем не менее, при одновременном действии корневой анок-сии и дефицита железа их эффекты суммировались. Снижение отношения суммы хлорофиллов к сумме каротиноидов в листьях опытных растений (табл. 1)
Таблица 1. Содержание пигментов в листьях гороха, выращенного в условиях дефицита железа и анаэробиоза корней
Вариант Хлорофилл а Хлорофилл Ь Хлорофиллы (а + Ь) Каротинои-ды Хлорофилл а Хлорофилл Ь Хлорофиллы (а + Ь) Каротиноиды
мг/г сырой массы листьев
Норма 02 и Ге 2.05 ± 0.37 0.66 ± 0.13 2.71 ± 0.24 0.63 ± 0.08 3.11 4.30
Дефицит 02 1.77 ± 0.30 0.58 ± 0.15 2.35 ± 0.13 0.55 ± 0.16 3.05 4.27
Дефицит Ге:
ярус 5 1.23 ± 0.14 0.40 ± 0.08 1.63 ± 0.38 0.39 ± 0.10 3.07 4.18
ярус 6 0.69 ± 0.18 0.19 ± 0.05 0.88 ± 0.23 0.24 ± 0.09 3.63 3.67
ярус 7 0.30 ± 0.12 0.07 ± 0.02 0.37 ± 0.08 0.12 ± 0.03 4.29 3.08
Дефицит 02 и Ге:
ярус 5 1.03 ± 0.16 0.30 ± 0.07 1.33 ± 0.09 0.34 ± 0.11 3.43 3.91
ярус 6 0.47 ± 0.07 0.12 ± 0.04 0.59 ± 0.11 0.17 ± 0.07 3.92 3.47
ярус 7 0.25 ± 0.06 0.06 ± 0.0
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.