ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 433, № 6, с. 842-845
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.352.465
ИЗМЕНЕНИЕ ДЕПОУПРАВЛЯЕМОГО ВХОДА КАЛЬЦИЯ В КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ ХАНТИНГТОНА
© 2010 г. Л. Н. Глушанкова, О. А. Зимина, В. А. Вигонт, член-корреспондент РАН Г. Н. Можаева, И. Б. Безпрозванный, Е. В. Казначеева
Поступило 06.04.2010 г.
В работе показано, что хантингтин с удлиненной полиглутаминовой последовательностью (Хтт138Р) увеличивает депоуправляемый вход Са2+ в клетки нейробластомы человека 8К-М-8Н. Это увеличение, вероятнее всего, обусловлено ростом экспрессии каналообразующих белков, но не за счет изменения активности уже имеющихся Са2+-каналов.
Болезнь Хантингтона (БХ) — аутосомально-доминантное нейродегенеративное нарушение, которое поражает в первую очередь ОЛБЛ-ерги-ческие срединные шипиковые нейроны стриату-ма (СШН). Болезнь вызывается полиглутамино-вым увеличением М-концевой области белка хан-тингтина (Хтт); этих глутаминовых остатков становится больше 35 (в норме их содержание в этом домене белка колеблется от 8 до 35) [1]. Однако взаимосвязь между измененным белком Хтт (Хттехр) и нейродегенерацией СШН остается неясной. Установлено, что при болезни Хантингтона Хттехр нарушает кальциевый гомеостаз посредством нескольких синергичных механизмов [2]. Хттехр усиливает функцию рецептора ММЭЛ и также способен воздействовать на функцию по-тенциалзависимых Са2+-каналов [3]. К тому же Хттехр прочно связывается с С-концом рецептора инозитол-1,4,5-трисфосфата (1Р3Я1) и увеличивает чувствительность этого рецептора к 1Р3. В результате низкие уровни глутамата, высвобождаемые из нейронов кортикостриатальной проекции, приводят к чрезмерному входу кальция через рецептор ММЭЛ и чрезмерному высвобождению кальция из внутриклеточных депо через 1Р3Я1 [4]. Общим результатом данных процессов является избыточное повышение уровня кальция в цитозоле СШН, что ведет к сверхнормальной аккумуляции Са2+ в митохондриях, а также к патологическому запуску Са2+-зависимых сигнальных путей, апопто-тической активности и СШН-дегенерации. Однако
Институт цитологии
Российской Академии наук, Санкт-Петербург Юго-западный медицинский центр Техасского университета в Далласе
до настоящего времени депоуправляемый вход кальция в клетки, являющиеся моделью БХ, непосредственно не исследовался. В связи с этим целью данной работы является изучение влияния хан-тингтина с удлиненной полиглутаминовой последовательностью (Xit-138Q) на депоуправляемый вход Са2+ в цитозоль клеток нейробластомы человека SK-N-SH.
Клетки нейробластомы человека SK-N-SH из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН культивировали в среде DMEM с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (80 мкг/мл гентамицина). За 1—2 дня до начала эксперимента клетки высевали на фрагменты покровных стекол (3 х 3 мм). Для лучшей адгезии клеток на стекле стекла покрывали 0.1%-ным полилизином.
Тр ансфекция. Была взята конструкция на основе вектора cPI ("Promega", США), содержащего Xit-138Q (последовательность, кодирующая белок хантингтин с 138 остатками глутами-на). Вставка X1T-138Q была легирована в вектор cPI, имеющий устойчивость к неомицину по XbaI-EcoRl-сайтам рестрикции. Для дальнейших экспериментов в качестве контроля сконструировали плазмиду cPI, содержащую Xit-15Q (последовательность, кодирующая белок хантингтин с 15 остатками глутамина, что является нормой). Для визуализации трансфицированных клеток проводили котрансфекцию с зеленым флуоресцентным белком (GFP). Котрансфекцию вели с помощью трансфицирующего агента Унифек-тин-56 (ИБХ, Москва).
При регистрации ионных токов использовали метод локальной фиксации потенциала (пэтч-кламп) в условиях регистрации тока от целой клетки (whole cell) [5]. Все измерения выполнены с помощью усилителя Axopatch 200B ("Axon Instruments", США). Сопротивление микроэлектродов 3—8 МОм. Последовательное сопротивление не компенсировали. Усиленный и предварительно отфильтрованный встроенным в усилитель двухполюсным фильтром Бесселя (частота среза 500 Гц) сигнал оцифровывали на частоте 5000 Гц с помощью платы АЦП L-305
ИЗМЕНЕНИЕ ДЕПОУПРАВЛЯЕМОГО ВХОДА КАЛЬЦИЯ Хтт-^ Хтт-138д
Интактные клетки
Хтт-138д (рСаб)
апй-Ытт шАЪ
апй-а-ШЪ шАЪ
Хтт (60 Кда)
а-тубулин (50 кДа)
Рис. 1. Уровень экспрессии белков Хтт-15Q и Хтт-138Q в клетках нейробластомы человека 8К-К-8Ы в стандартных условиях инкубации и при выдерживании клеток после трансфекции в среде с пониженным содержанием кальция (рСаб).
('^-Сагё", Москва). При записях интегральных токов клетки потенциал мембраны поддерживали на —40 мВ. Периодически (каждые 5 с) потенциал на мембране изменяли до —100 мВ (на 30 мс), а затем постепенно с постоянной скоростью 1 мВ/мс его величину изменяли до +70 мВ. Записанные токи нормировали относительно емкости клетки (1б—28 пФ). Записи, полученные до активации исследуемых токов, использовали для вычитания тока утечки и тока через другие каналы.
Большинство современных исследователей считает, что мутантный белок Хттехр приобретает "токсическое усиление функции" [б]. Одной из токсических функций белка Хттехр является дестабилизация нейрональной Са2+-сигнализации. Так, исследования мозга пациентов с БХ, а также модельные эксперименты на мышах показали, что в мозге происходят последовательные изменения уровней экспрессии белков Са2+-сигнали-зации [7]. На основании этих данных рядом специалистов была выдвинута "Кальциевая гипотеза БХ" [8].
Одним из путей нарушения кальциевого го-меостаза в СШН при БХ может являться нарушение депоуправляемого входа кальция в эти клетки. В нашей работе в качестве клеточной модели БХ использовались клетки нейробластомы человека 8К-М-8Ы, трансфицированные белком Хтт-
15Q (контроль) и Хтт-138Q (модель). Эффективность соответствующих трансфекций подтверждена при помощи иммуноблоттинга (рис. 1).
Анализ проведенных электрофизиологических экспериментов показал, что в контрольных клетках нейробластомы 8К-М-8Ы, т.е. в клетках трансфицированных конструкцией Хтт-15Q в ответ на пассивное опустошение депо, вызванное тапсигаргином, активируется кальциевый ток (рис. 2а). Величина тока очень мала и не отличается от величины тока, зарегистрированной нами на интактных клетках 8К-М-8Ы (данные не представлены). Регистрация электрической активности клеток 8К-М-8Ы, трансфицированных конструкцией Хтт-138Q, т.е. клеток, являющихся моделью болезни Хантингтона, показала значительное увеличение кальциевого тока (рис. 2а). Обсчет полученных результатов выявил более чем 5-кратное увеличение тока.
Аналогичные данные были получены нами при оценке временного хода развития эффекта пассивного опустошения кальциевых депо. Через 100 с после подачи агента ток увеличивался до 1.6пА/пФ (рис. 2б). Поскольку считается, что тапсигаргин не влияет на другие клеточные сигнальные пути, то зарегистрированный ток можно приписать работе депоуправляемых каналов. Таким образом, можно заключить, что аномальный
844
ГЛУШАНКОВА и др.
мВ С
Рис. 2. Влияние экспрессии белков Хтт-15Q и Хтт-138Q на депоуправляемый вход Са2+ в клетках 8К-К-8Н. Каждая кривая на а представлена как среднее из 6—9 экспериментов. а — средняя вольт-амперная характеристика токов после пассивного опустошения депо, вызванного приложением 1 мкМ тапсигаргина к клеткам 8К-К-8Н, экспрессирую-щим контрольный белок Хтт-15Q (1), белок хантингтин с увеличенной полиглутаминовой последовательностью (Хтт-138Q) (3) и к клеткам, экспрессирующим Хтт-138Q, выдерживаемым в среде со сниженным содержанием кальция в течение 24 ч (2), на стационарном уровне активности исследуемых токов (примерно через 250 с после подачи тапсигаргина). б — развитие тока кальция (отнесенного к емкости клетки) через плазматическую мембрану клеток 8К-К-8Н, экспрессирующих контрольный белок Хтт-15Q (1), хантингтин с увеличенной полиглутаминовой последовательностью (Хтт-138Q) (2) и клеток, экспрессирующих Хтт-138Q, выдерживаемых в среде со сниженным содержанием кальция в течение 24 ч (3), при потенциале —80 мВ на стационарном уровне активности исследуемых токов (примерно через 250 с после подачи тапсигаргина). Представлены данные трех репрезентативных экспериментов.
кальциевый сигнал, наблюдаемый в клетках, затронутых БХ, может быть также определен гиперувеличением депоуправляемого тока.
Усиление тока кальция в модели БХ может определяться двумя независимыми параметрами — изменением свойств существующих каналов или увеличением числа каналов за счет экспрессии большого количества каналообразующих белков. Для того, чтобы определить причину увеличения тока, была проведена серия дополнительных экспериментов. Предположили, что если клетка после трансфекции Хтт-138Q запускает гиперэкспрессию канальных белков из-за нарушенного кальциевого гомеостаза, то практически полное исключение ионов Са2+ из наружной среды сразу после трансфекции позволит "обмануть" клеточную машину и не допустить изменения экспрессии белков, т.е. увеличения тока наблюдаться не будет. Если же ток в данных условиях будет увеличен, то это будет свидетельствовать об изменении свойств каналов, а не их числа.
Анализ результатов экспериментов, проведенных на клетках, являющихся моделью БХ, которые после трансфекции были помещены в среду с пониженным содержанием кальция (рСаб), показал, что депоуправляемый вход в данных условиях не отличается от контроля (рис. 2). Кроме того, при помощи иммуноблоттинга с моноклональ-
ными антителами против хантингтина выявлено, что экспрессия самого Хтт-138Q при выдерживании трансфицированных клеток в среде с пониженным содержанием кальция не изменяется по сравнению со стандартными условиями (рис. 1). Иначе говоря, наблюдаемый эффект не связан с уменьшением в клетке количества Хтт-138Q. Полученные данные позволяют с большой долей уверенности утверждать, что 5-кратное увеличение депоуправляемого тока в клеточной модели БХ происходит за счет усиления экспрессии ка-налообразующих белков.
Как уже указывалось выше, рядом исследователей была выдвинута "кальциевая гипотеза БХ", которая постулировала, что нарушения нейро-нальной кальциевой сигнал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.