научная статья по теме ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХЕМОКИНОВ, ЦИТОКИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ СЕЛАНКА И ЕГО ФРАГМЕНТОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХЕМОКИНОВ, ЦИТОКИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ СЕЛАНКА И ЕГО ФРАГМЕНТОВ»

ГЕНЕТИКА, 2011, том 47, № 5, с. 711-714

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 577.21:577.171.7:577.175.823

ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХЕМОКИНОВ, ЦИТОКИНОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ СЕЛАНКА И ЕГО ФРАГМЕНТОВ

© 2011 г. Т. А. Коломин, М. И. Шадрина, П. А. Сломинский, С. А. Лимборская, Н. Ф. Мясоедов

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва 123182

e-mail: kotimur@img.ras.ru Поступила в редакцию 17.01.2011 г.

В настоящее время ведется активное изучение фармакологических препаратов на основе эндогенных регуляторных пептидов как наиболее перспективного класса лекарственных средств, практически лишенных побочных эффектов. К препаратам данного класса относится синтетический аналог тафтцина — селанк. Селанк, с одной стороны, оказывает анксиолитическое и ноотропное действие, а с другой — обладает выраженными противовирусными свойствами. В ходе исследования иммуномодулирующего действия селанка мы показали, что как целый пептид, так и отдельные его фрагменты способны вызывать достоверные изменения в экспрессии генов хемокинов, цитокинов и их рецепторов в селезенке мыши через 6 и 24 ч после однократного введения. Также нами показано, что изменение уровня мРНК большинства рассмотренных генов наблюдается после введения Gly-Pro, ранее предложенного в качестве минимального фрагмента селанка с противовирусной активностью — фармакофора.

Селанк — регуляторный пептид, синтетический аналог тафтцина (короткого фрагмента Thr-Lys-Pro-Arg тяжелой цепи иммуноглобулина G человека), удлиненный с С-концевой части три-пептидом Pro-Gly-Pro для повышения метаболической стабильности и увеличения продолжительности действия конечного пептида [1, 2]. Се-ланк обладает выраженным анксиолитическим и ноотропным действием и высокоэффективен при лечении тревожных и тревожно-астенических расстройств, приводит к активации и оптимизации мнестических и когнитивных функций мозга, процессов обучения и памяти [3, 4].

Наряду с вышеописанными функциями се-ланк также обладает выраженной иммунотроп-ной активностью и способен индуцировать секрецию интерферонов. Противовирусное действие селанка было обнаружено в отношении вируса гриппа A/Aichi2/68 (штамм H3N2) как in vivo, так и in vitro в экспериментальных моделях [5]. В предыдущих исследованиях, направленных на поиск генов, изменяющих свою экспрессию под действием селанка, нами было показано, что введение селанка вызывает транскриптомный ответ клеток гиппокампа и селезенки крысы. При этом наиболее значительное изменение уровня мРНК было отмечено для гена Cx3cr1 в селезенке крысы после однократного введения препарата [6].

Проведенные ранее исследования показали, что глипролины способны оказывать собственное физиологическое действие, а содержащие их синтетические пептиды могут сочетать разные физиологические свойства своих структурных единиц [7].

В связи с этим для более детального изучения иммуномодулирующей активности селанка нами была проведена оценка изменения экспрессии генов хемокинов и цитокинов в селезенке мыши под влиянием как целого пептида селанка Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, так и трех его фрагментов: Gly-Pro (GP), Arg-Pro-Gly-Pro (RPGP) и тафтцина Thr-Lys-Pro-Arg, через 6 и 24 ч после однократного введения пептидов.

В качестве экспериментального животного была выбрана мышь, так как данный вид является наиболее подходящим модельным объектом для иммунологических исследований, а селезенка — один из основных органов иммунной системы. В эксперименте использовали самцов белых беспородных мышей, которых разделили на 10 групп (по 10 особей co средним весом 20 г) . Из них две контрольные группы для двух временных точек (6 и 24 ч) и восемь экспериментальных — по одной для каждого пептида и соответствующей временной точки. Животным из контрольных групп однократно внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Животным из экспериментальных групп однократно внутрибрюшинно вводили селанк или его фрагменты (из расчета 100 мкг/кг веса). Животных из контрольных и экспериментальных групп декапитировали спустя 6 или 24 ч в соответствии с их принадлежностью к выбранной временной точке, немедленно извлекали селезенку и замораживали ее при —70°С.

Тотальную РНК из тканей селезенки выделяли с использованием набора RNeasy® Mini Kit ("Qiagen", Израиль). На ее основе с помощью набора RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Syn-

Относительное изменение уровня мРНК генов хемокинов, цитокинов и их рецепторов в селезенке мыши через 6 и 24 ч после введения селанка или его фрагментов (в таблице представлены только статистически значимые результаты)

Ген Название гена Селанк GP RPGP Тафтцин

6 ч 24 ч 6 ч 24 ч 6 ч 24 ч 6 ч 24 ч

Хемокины Ccl3 СС-хемокиновый лиганд 3 1.42* 1.30**

Ccl7 СС-хемокиновый лиганд 7 0.87**

Ccl9 СС-хемокиновый лиганд 9 0.72*

Ccl11 СС-хемокиновый лиганд 11 0.84*

Ccl17 СС-хемокиновый лиганд 17 1.13** 1.63**

Ccl19 СС-хемокиновый лиганд 19 0.64*

Ccl20 СС-хемокиновый лиганд 20 1.38* 0.37**

Cxcl10 СХС-хемокиновый лиганд 10 0.73** 0.79*

Cxcl12 СХС-хемокиновый лиганд 12 0.81** 0.82** 0.87**

Cxcl15 СХС-хемокиновый лиганд 15 0.74** 0.80**

Рецепторы хемокинов Ccr2 СС-хемокиновый рецептор 2 1.53*

Ccr4 СС-хемокиновый рецептор 4 1.17*

Xcr1 ХС-хемокиновый рецептор 1 0.86* 0.80** 0.75** 0.81** 0.88**

Цитокины Il10 Интерлейкин 10 1.22* 0.69*

Il16 Интерлейкин 16 0.77*

Il1f8 Интерлейкин 1-8 1.40**

Il20 Интерлейкин 20 0.76** 0.77*

Ifng Гамма-интерферон 1.23* 1.25*

Itgam Интегрин, альфа-М 0.02** 0.47** 0.02** 0.02**

Itgb2 Интегрин, бета-2 0.81** 0.64**

Scye1 Малый воспалительный цитокин Е1 1.32*

Рецепторы цитокинов Il1r2 Рецептор интерлейкина 1, тип 2 0.08* 4.46** 0.09** 3.09*

Il2rg Рецептор интерлейкина 2, гамма-цепь 0.57* 0.43** 0.63** 0.51**

Il5ra Рецептор интерлейкина 5, альфа 0.83*

Il13ra1 Рецептор интерлейкина 13, альфа-1 0.82* 0.78*

Примечание. Базовый уровень экспрессии равен 1. *p < 0.05; **p < 0.01.

thesis Kit ("Fermentas", Литва) синтезировали первую цепь кДНК.

Для анализа было отобрано 25 генов из четырех групп: гены хемокинов (Ccl3, Ccl7, Ccl9, Ccl11, Ccl17, Ccl19, Ccl20, Cxcl10, Cxcl12, Cxcl15), гены рецепторов хемокинов (Ccr2, Ccr4, Xcr1), гены цитокинов (Il10, Il16, Il1f8, Il20, Ifng, Itgam, Itgb2, Scye1) и гены рецепторов цитокинов (Il1r2, Il2rg, Il5ra, Il13ra1). Данные гены вовлечены в каскад иммунных реакций, протекающих во время воспалительных процессов. В качестве генов сравнения были отобраны три гена домашнего хозяйства: Actb, Hprt1 и Hsp90ab1. Анализ влияния се-

ланка и трех его фрагментов на экспрессию данных генов в селезенке мыши проводили при помощи метода ПЦР в реальном времени на приборе Mx3000P™ Real-Time QPCR System ("Strat-agene Equipment", США) с использованием набора SYBR Green I ("Синтол", Россия) и коммерческих праймеров RT2 qPCR Primer Assay-SYBR®Green ("SABioscience", США). Полученные значения пороговых циклов реакций (Ct) были нормализованы относительно Ct генов домашнего хозяйства и статистически обработаны с помощью программного обеспечения "Relative Expression Software Tool-384", version 2 [8].

ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХЕМОКИНОВ, ЦИТОКИНОВ

713

Проведенная в ходе исследования количественная оценка показала, что при введении се-ланка ответ наибольшего числа генов наблюдается спустя 24 ч после введения пептида (таблица). Введение ОР, напротив, приводит к достоверному изменению уровня мРНК наибольшего числа генов через 6 ч после инъекции. Изменение уровня мРНК наибольшего числа генов хемокинов было отмечено через 6 ч после введения ОР и тафтцина, а также спустя сутки после введения селанка. Было отмечено схожее достоверное снижение уровня мРНК гена Схс112, в среднем в 1.3 раза через 6 ч после введения ОР, ЯРОР и тафтцина. Достоверного изменения экспрессии данного гена после введения селанка выявлено не было. Гены хемокиновых рецепторов Ссг2 и Ссг4 характеризовались достоверным повышением уровня экспрессии только после введения ОР. Спустя сутки после введения каждого из пептидов наблюдалось снижение уровня мРНК гена Хсг1, кодирующего рецептор для активатора хемотакти-ческой активности лимфоцитов.

Через 6 ч после введения ОР, ЯРОЯ и тафтци-на наблюдалось значительное падение уровня мРНК гена Itgam — в среднем в 50 раз и двукратное падение уровня мРНК данного гена спустя сутки после введения ОР. Также был отмечен достоверный рост экспрессии гена, кодирующего гамма-интерферон (Щ), в 1.2 раза через 6 ч после введения тафтцина и селанка.

Для гена 111г2 наблюдалось значительное падение уровня мРНК (в 14 раз) через 6 ч после введения селанка, а затем рост уровня мРНК данного гена в 4.5 раза спустя сутки после введения пептида. Также отмечено падение уровня экспрессии данного гена в 11 раз через 6 ч после введения ОР и его рост в 3 раза спустя сутки после введения тафтцина. Ген 112кодирующий общую субъединицу рецепторов различных интерлейкинов, характеризовался падением уровня мРНК через 6 ч после введения каждого из пептидов.

Полученные результаты показали, что введение селанка и каждого из его фрагментов, рассмотренных в данном исследовании, оказывает достоверное влияние на изменение уровня мРНК генов хемокинов, цитокинов и их рецепторов, причем активация некоторых из них наблюдается даже спустя сутки после однократного введения пептидов. Это позволяет говорить о том, что се-ланк принимает участие в регуляции воспалительных процессов и способен вызывать направленное изменение в экспрессии генов, вовлеченных в иммунный ответ организма.

Изменение уровня мРНК большего количества отобранных генов наблюдается после введе-

ния ОР, причем активация большинства из них отмечается уже через 6 ч после введения данного пептида. Таким образом, мы можем предположить, что минимальным фрагментом селанка, играющим роль фармакофора, является дипептид О1у-Рго.

Для выявления более детальной картины действия селанка и его фрагментов на экспрессию генов, вовлеченных в проц

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком