ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 675-679
УДК 581.132
ИЗМЕНЕНИЕ ЛЕКТИНОВОЙ АКТИВНОСТИ ПРОРОСТКОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ МИКОПЛАЗМАМИ
© 2004 г. Т. В. Трифонова*, Н. Н. Максштова*, О. Ä. Тимофеева**, В. М. Чернов*
*Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН, Казань, 420111; e-mail: maksyutova@yandex.ru **Казанский государственный университет, Казань, 420008; e-mail: Olga.Timofeeva@ksu.ru Поступила в редакцию 26.01.2004 г.
Обнаружено увеличение активности растворимых лектинов проростков озимой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Мироновская 808 после инфицирования микоплазмами Acholeplasma laidlawii 118 через 1 сут в листьях и 2 сут - в корнях. Электрофоретическое разделение кислоторастворимых белков листьев в ПААГ позволило выявить в инфицированных микоплазмами растениях увеличение содержания полипептидов 76, 48, 25 и 18 кДа, появление полипептидов 22 и 20 кДа и исчезновение полипептида 14 кДа. Полипептид 18 кДа является субъединицей аглютинина зародыша пшеницы. Изменение активности лектинов может быть неспецифическим ответом растений на действие патогена.
Исследование молекулярных механизмов взаимодействия растений и патогенов является в настоящее время одним из важнейших направлений молекулярной биологии. Способность фитолек-тинов распознавать слабые различия в структуре углеводов у патогенов послужила основанием для предположения об участии лектинов в межклеточных взаимодействиях и включении защитных механизмов растения [1].
Показана роль лектинов в механизмах формирования фитоиммунитета [2-4]. Известно, что экзогенный фитолектин конканавалин А, взаимодействуя со специфическими рецепторами на плазмалемме клеток гороха, активирует фосфо-инозитольный путь с последующей индукцией синтеза фитоалексина [5]. Благодаря лектиноподоб-ному веществу, выделяемому клетками паренхимы картофеля, клетки авирулентных бактерий агглютинируются в сгустки, которые впоследствии лизируются [6]. По-видимому, агглютинация представляет собой первичный этап распознавания хозяином патогена, что служит сигналом для сверхчувствительной гибели клеток и образования фитоалексинов [7].
Агглютинин зародыша пшеницы (АЗП) высоко специфичен к ^-ацетилглюкозамину и олиго-мерам хитина, на основании чего было высказано предположение о его защитной роли при заражении растений хитинсодержащими фитопатогена-ми [8]. Данные литературы свидетельствуют об участии АЗП в ответе пшеницы на грибной патогенез, обработку препаратами, повышающими устойчивость к различным болезням [9].
Микоплазмозы растений достаточно широко распространены, но сведений о вовлечении лектинов в процессы развития защитных реакций растений при инфицировании микоплазмами, практически нет [2, 10].
Цель работы - выявление изменений активности растворимых лектинов растений пшеницы при инфицировании микоплазмами Acholeplasma laidlawii 118.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили листья и корни проростков озимой пшеницы Triticum aestivum L. сорта Мироновская 808.
Семена перед посевом стерилизовали 2%-ным перманганатом калия (15 мин), промывали дистиллированной водой и проращивали в кюветах на увлажненной дистиллированной водой фильтровальной бумаге при 23°С в течение 7 сут. Интенсивность падающего света составляла 30 кЭрг/с/1 см2 при 12 ч фотопериоде. Семидневные проростки пшеницы инфицировали клетками микоплазмы (Acholeplasma laidlawii 118), любезно предоставленной д.б.н. И.Г. Скрипалем (Институт микробиологии и вирусологии им. Заболотного НАН Украины, г. Киев). В нижнюю часть стебля микрошприцем вводили 5 мкл культуры с исходным титром 105 КОЕ/мл. Культивирование клеток A. laidlawii проводили на среде Эдварда [11].
Для экстрагирования растворимых лектинов навеску растительного материала (0.5 г) растирали с ацетоном и многократно отмывали, освобождаясь от присутствия пигментов, затем гомо-
675
5*
Рис. 1. Динамика активности растворимых лектинов (% от контроля) в листьях (а) и корнях (б) проростков озимой пшеницы сорта Мироновская 808 при инфицировании микоплазмами.
генизировали в 5 мл 0.05 М HCI, постоянно перемешивая в течение 1 ч при 4°С, и центрифугировали при 10000 g 20 мин. Осадок промывали половинным от исходного объемом кислоты, супернатанты объединяли [12]. После нейтрализации 1 М Na-фос-фатным буфером (рН 7.4) супернатант центрифугировали при 10000 g 10 мин и использовали для дальнейшего анализа.
Активность лектинов определяли методом агглютинации трипсинизированных эритроцитов барана. Реакцию проводили в специальных планшетах с U-образными лунками. Для этого готовили серию последовательных двукратных разведений белкового экстракта лектинов (10 разведений), в каждую лунку добавляли 0.05 мл 2%-ной суспензии эритроцитов и смесь оставляли при комнатной температуре на 1-2 ч. Титр лектина характеризовался максимальным разведением или минимальной концентрацией его в растворе, при которой наблюдалась агглютинация эритроцитов. Активность лектинов (P) рассчитывали по формуле: P = 1/A, где A - минимальное количество белка, способное вызвать агглютинацию. Содержание белка в выделенных экстрактах определяли по Бредфорд.
Получение бараньих эритроцитов и их трипси-низацию проводили по методу, описанному в работе Луцик и др. [13].
Одномерный электрофорез белков проводили в 12%-ном ПААГ в присутствии 2%-ного ДДС-Na по методу Лэммли [14] на приборе для электрофореза в вертикальных пластинах геля. В качестве маркеров ("Serva", Германия) использовали следующие белки (кДа): БСА - 66, яичный альбумин - 45, трипсиноген - 24, Р-лактоглобулин - 18.4, лизоцим - 14.3. После фиксации гели окрашивали 0.1%-ным кумасси G-250 ("Serva", Германия).
На рисунках приведены средние арифметические из 3 биологических повторностей. Большинство данных обработано статистически с помощью программы Statgraph, а графики построены в программе Microsoft Graph.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследовали изменения лектиновой активности растений озимой пшеницы Мироновская 808 при инфицировании микоплазмами A. laidlawii 118. Активность растворимых лектинов (рис. 1а) в листьях через 3 ч после инфицирования микоплазмами изменялась незначительно, через 7 ч - увеличивалась, оставаясь более высокой по сравнению с контролем до 3 сут, затем снижалась, а после 5 сут вновь начинала возрастать, достигая уровня контроля. Сходные результаты по изменению активности лектинов во фракции легкорастворимых белков, выделенных из листьев гороха (Pisum sativum L.), инфицированных Y-вирусом картофеля (Solanum tuberosum L.), были получены Бабошей и Ладыгиной [15]. В этих экспериментах инфицирование растений, вызывающее реакцию сверхчувствительности, приводило к повышению активности лектинов примерно через 1 сут после инокуляции вирусом, после чего следовало резкое снижение активности в период, предшествующий образованию некрозов.
В корнях значительное увеличение активности растворимых лектинов при заражении микоплазмами происходило лишь ко 2 сут, после чего наблюдалось ее снижение (рис. 16). Как следует из наших данных, листья характеризовались более быстрой ответной реакцией растворимых лектинов на мико-плазменную инфекцию, по сравнению с корнями.
Наблюдаемые изменения активности лектинов при инфицировании микоплазмами и, как было показано ранее, при низкотемпературном закаливании [10] свидетельствуют об участии лектинов в формировании стрессового состояния или неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы [16].
Изменения в активности лектинов могут быть обусловлены, с одной стороны, конформацион-
ными перестройками молекул белка, в ходе которых изменяется доступность углеводсвязываю-щих центров, а с другой стороны - увеличением содержания этого белка.
Известно, что при инфицировании патогенами в клетках растений активируются системы защиты, приводящие к экспрессии генов [17, 18]. При этом происходит замедление синтеза одних белков и усиление образования других, что проявляется в изменении электрофоретического спектра синтезируемых белков. В наших экспериментах инфицирование растений озимой пшеницы микоплазмами А. ШМам>и 118 оказало влияние на полипептидный состав кислоторастворимых белков, одним из которых является АЗП. Электро-форетическое разделение белков в ПААГ (рис. 2) позволило обнаружить в инфицированных микоплазмами растениях пшеницы увеличение содержания полипептидов 76, 48, 25 и 18 кДа, появление полипептидов 22 и 20 кДа и исчезновение полипептида 14 кДа. Исходя из данных литературы, полипептид 18 кДа является субъединицей лекти-на АЗП [9].
В природных условиях заражение микоплазмами происходит, как правило, с помощью насекомых-переносчиков - цикадок (известно более 60 видов) [19], которые, питаясь пластическими веществами клеток флоэмы, тонким стилетом вводят микоплазму вместе со слюной внутрь живых клеток растения-хозяина. Мы заражали растения микоплазмами методом субэпидермальной инъекции. Этот способ инфицирования напоминает впрыскивание микоплазм через жало насекомых и представляется наиболее близким к природному. Суспензия, содержащая клетки микоплазм, проникает под давлением в растения без грубого повреждения тканей. Зона инфицирования при этом не ограничивается местом проникновения иглы, а охватывает значительную часть близлежащих тканей [20]. Для выяснения возможности влияния компонентов культуральной среды и механического повреждения микрошприцом часть растений была подвержена инъекции средой, не содержащей клетки А. ЫМам>и. Как видно из сравнения электрофореграмм белков (рис. 2), выделенных из контрольных растений и растений, которым была сделана инъекция культуральной средой, компоненты среды и механическое повреждение микрошприцем не оказывали значительного влияния на белковый состав растений. Следует отметить, что инъекция культуральной средой не влияла и на активность лектинов.
Известно, что патогены и подвергающиеся их атаке растения могут одновременно образовывать элиситоры различных типов, в связи с чем возможно включение и паралельное функциони-
кДа
66-
45-
24-
18.7-
14.3-
кДа
— 76
— 48
25
22 -20
18 14
12 3 4
Рис. 2. Влияние микоп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.