ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 778-783
УДК 581.1:577.115:582.261
ИЗМЕНЕНИЕ ЛИПИДНОГО СОСТАВА Тка1аББШга рБеийвпапа В ТЕЧЕНИЕ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА
© 2004 г. Н. В. Жукова
Институт биологии моря Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток
Поступила в редакцию 04.06.2003 г.
Исследован состав липидов и ЖК морской диатомовой водоросли ТНа1а881оз1га рзеыйопапа, выращенной в культуре. Относительное содержание отдельных классов липидов и состав их ЖК варьировали в течение жизненного цикла. Доля полярных липидов, являющихся структурными компонентами клеточных мембран, увеличивалась в период активного клеточного деления и в период образования покоящихся форм клеток. Изменение пропорции классов липидов приводило к изменению состава ЖК общих липидов. Предполагается, что в клетках в покоящейся стадии аккумулируются структурные компоненты фотосинтетических и клеточных мембран, таким образом, обеспечивается быстрый рост клеток и массовое развитие вида при возникновении благоприятных условий в природной среде.
Thalassiosira pseudonana - покоящаяся стадия - липиды - жирные кислоты
Флуктуации условий среды влияют на рост и репродукцию планктона. Микроводоросли при благоприятных условиях реагируют вспышками цветения, а при истощении питательных веществ в среде и изменении освещенности некоторые виды исчезают из планктона. При этом микроводоросли уходят в "спячку", дожидаясь благоприятного для вегетации периода. Как хорошо известно, некоторые диатомовые водоросли в неблагоприятные периоды оседают на дно [1], образуя покоящиеся клетки и споры [2-4]. Считается, что образование покоящихся стадий является стратегией выживания микроводорослей при неблагоприятных условиях окружающей среды и, следовательно, для поддержания популяции диатомовых в морских экосистемах. Эти процессы, включая процесс спорообразования, хорошо описаны [5-7]. Исследование покоящихся стадий ограничено изучением образования спор при недостатке питательных веществ в среде, а также их морфологии, прорастания и выживания. Молекулярные механизмы происходящих адаптационных процессов практически не исследованы. Работы комплексного характера, описывающие не только морфологические, но и биохимические превращения, единичны [8].
Сокращение: ПЛ - полярные липиды.
Адрес для корреспонденции: Жукова Наталья Владимировна. 690041 Владивосток, ул. Пальчевского, 17, Институт биологии моря ДВО РАН. Факс: (3742) 31-09-00; электронная почта: nzhukova@hotmail.com
Род Thalassiosira - один из ведущих компонентов морского фитопланктона. Развитие водорослей видов Па1а88Ю81га обычно наблюдается весной, что в значительной степени связано с притоком и подъемом к поверхностным слоям биогенных элементов, вызванных весенней стратификацией вод. В литературе было отмечено, что в морской воде при богатом содержании биогенов в планктоне доминируют талассиозиры [9]. Известна способность талассиозир образовывать покоящиеся споры, которые хорошо изучены у некоторых видов [9]. Список видов, у которых отмечена покоящаяся стадия, продолжает расширяться [4, 10, 11]. Развитие Па1аз8юз1га pseudonana в культуре характеризуется периодом активного вегетативного роста (логарифмическая стадия роста) и периодом относительного покоя, когда клетки в покоящейся стадии прекращают деление и оседают на дно (фаза позднего стационара) (Орлова Т.Ю., личное сообщение).
В этой работе исследованы изменения состава липидов и ЖК, происходящие при длительном культивировании Т. pseudonana. Проанализированы вегетативные клетки и клетки в покоящейся стадии с целью определения роли липидов в физиологии и экологии этого организма.
МЕТОДИКА
Культура диатомовой водоросли Thalassoisira pseudonana была выделена из планктонных проб, собранных в мае-июне 1999 г. в Амурском заливе Японского моря. Выделение и поддержание микроводоросли в культуре осуществляли традици-
Экспозиция,сут
Рис. 1. Кривая роста Thalassiosira pseudonana в культуре.
онным методом [12]. Культуру выращивали при 20°С на питательной среде "f", приготовленной на фильтрованной морской воде [13]. Для освещения использовали флуоресцентные лампы (3.5 клк), с чередованием свет-темнота (12 + 12 ч).
Клетки водоросли, выращенной в культуре, осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 g. Липиды экстрагировали модифицированным методом Bligh и Dyer [14]. Разделение ли-пидов на классы проводили методом ТСХ на си-ликагеле на пластинках Chromosorb. В качестве системы растворителей была использована смесь гексан : диэтиловый эфир : уксусная кислота (70 : 30 : 1 по объему). Липиды проявляли опрыскиванием ТСХ пластинки 10%-ной серной кислотой в этаноле с последующим нагреванием при 180°С в течение 5 мин. Концентрацию липидов определяли, анализируя предварительно сканированное изображение ТСХ пластинки, с использованием программы "Видеоденситометр Sorbfil" (демонстрационная версия). Препаративное разделение липидов выполняли ТСХ на силикагеле в системе растворителей, указанной выше. Участки силикагеля из зон, которые содержали полярные липиды (ПЛ), включающие фосфолипиды и гликолипиды, а также ТАГ, быстро соскребали, и липиды элюировали смесью хлороформ : метанол (1 : 1 по объему). Метиловые эфиры ЖК получали этерификацией липидов по известной методике [15] и очищали методом ТСХ в бензоле. Анализ эфиров ЖК выполняли на хроматографе Shimadzu GC-9A с пламенно-ионизационным детектором и оснащенном станцией обработки данных Chromatopac C-R3A. Условия: колонка капиллярная кварцевая (30 м х 0.25 мм) с фазой Supelco-wax, температура 210°С, газ-носитель - гелий. ЖК идентифицировали по относительным временам удерживания и значениям "углеродных чисел". Опыты проведены в 3 повторностях, в таб-
Время культивирования, сут
Рис. 2. Изменение состава липидов Thalassiosira pseudonana в течение жизненного цикла. 1 - ПЛ, 2 - ТАГ, 3 - стерины, 4 - свободные ЖК, 5 -углеводороды.
лице и на рисунках указаны средние значения и стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Кривая роста T. pseudonana показана на рис. 1. Наибольшая численность клеток в культуре была зарегистрирована на 6-е сутки, когда популяция переходит в стационарную стадию роста. Образцы для анализа липидов брали каждые трое суток после начала культивирования. Первая точка приходилась на начало культивирования, вторая (3 сут) - на линейную фазу роста, третья (6 сут) - на начало стационарной фазы и далее 10-20 сут - на поздний стационар, когда происходит образование покоящихся клеток водоросли. Подобные особенности развития в культуре отмечены и для другого вида диатомовых Chaetocer-os salsugineus, для которого показано образование покоящихся форм клеток на 9-10-е сутки роста культуры [12].
Анализ липидов по классам показал (рис. 2), что ПЛ, состоящие из фосфолипидов и гликоли-пидов, являлись главными компонентами липид-ного экстракта T. pseudonana на всех стадиях жизненного цикла, и в исходной культуре составляли около 40% от общих липидов. ТАГ и стерины содержались в меньших концентрациях, тогда как углеводороды, свободные ЖК и пигменты являлись минорными компонентами. В течение жизненного цикла происходили заметные изменения относительного содержания главных классов липидов (рис. 2). Содержание ПЛ в течение логарифмической стадии роста возросло с 44.0% до 60.9% на 3-и сутки. При переходе культуры в стационарную фазу (6 сут) происходило увеличение пропорции ТаГ более, чем в три раза с 10.1 до 31.1%, тогда как доля ПЛ уменьшалась до 44.9%. К 20-м суткам, в период образования покоящихся клеток, наблюдалось увеличение доли ПЛ до 70.0%.
Состав жирных кислот общих липидов ТНа1аззюз1га рзеыйопапа при длительном культивировании (весовые %% от общего содержания)
ЖК 3 сут 6 сут 10 сут 14 сут 20 сут
12 : 0 0.8 ± 0.2 0.4 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.2 ± 0.1
14 : 0 10.8 ± 1.3 11.2 ± 1.2 10.5 ± 1.7 12.3 ± 0.9 12.4 ± 1.2
14 : 1 0.9 ± 0.2 1.1 ± 0.2 0.8 ± 0.2 0.5 ± 0.1 0.5 ± 0.1
15 : 0-атеизо 0.7 ± 0.1 1.6 ± 0.2 1.0 ± 0.1 1.5 ± 0.3 1.2 ± 0.2
15 : 0-атеизо 0.5 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.7 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.4 ± 0.1
15 : 0 1.1 ± 0.1 1.7 ± 0.4 1.3 ± 0.3 0.9 ± 0.1 1.1 ± 0.1
15 : 1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.2 ± 0.1
16 : 0 17.7 ± 1.4 18.1 ± 1.2 17.1 ± 0.9 14.7 ± 1.1 13.4 ± 1.5
16 : 1ю7 11.3 ± 1.2 10.3 ± 0.9 15.4 ± 1.2 17.2 ± 1.5 13.2 ± 1.2
17 : 0-атеизо 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.2 0.5 ± 0.1 0.6 ± 0.1 0.8 ± 0.1
17 : 0-атеизо 0.6 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.6 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.7 ± 0.1
16 : 2ю4 4.8 ± 0.3 4.8 ± 0.5 2.6 ± 0.2 4.8 ± 0.8 2.0 ± 0.2
17 : 0 0.2 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.2 ± 0.1
16 : 3ю4 12.5 ± 1.62 9.4 ± 1.3 11.8 ± 0.4 13.6 ± 1.2 17.5 ± 1.1
16 : 4ю1 0.5 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.5 ± 0.1 1.0 ± 0.2
18 : 0 5.6 ± 0.3 6.7 ± 0.9 5.3 ± 0.6 2.5 ± 0.3 2.5 ± 0.4
18 : 1ю9 6.8 ± 0.7 8.0 ± 0.8 6.4 ± 0.7 2.6 ± 0.4 2.6 ± 0.3
18 : 1ю7 1.4 ± 0.5 1.9 ± 0.6 1.5 ± 0.2 1.0 ± 0.2 1.7 ± 0.3
18 : 2ю6 2.4 ± 0.3 3.0 ± 0.3 3.5 ± 0.3 1.4 ± 0.3 1.3 ± 0.2
18 : 3ю6 0.5 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1
18 : 3ю3 0.4 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.5 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.4 ± 0.1
18 : 4ю3 3.7 ± 0.3 3.1 ± 0.4 3.3 ± 0.2 4.4 ± 0.5 4.8 ± 0.3
20 : 0 0.3 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.1 ± 0.1 0.2 ± 0.1
20 : 5ю3 12.9 ± 1.1 13.4 ± 1.3 13.4 ± 0.8 17.6 ± 1.6 19.3 ± 1.5
22 : 6ю3 1.2 ± 0.2 2.5 ± 0.2 1.5 ± 0.2 2.0 ± 0.1 2.2 ± 0.2
Насыщенные 36.1 38.3 34.7 30.6 29.6
Мононенасыщенные 20.8 21.3 24.6 21.5 18.2
Полиненасыщенные 38.9 37.0 37.0 45.0 48.7
Состав ЖК общих липидов Т. pseыdonana был характерным для диатомовых водорослей [16]. Он относительно прост и включал 5 главных кислот: 14:0, 16:0, 16:1ю7, 16:3ю4 и 20:5ю3, которые в сумме составляли 62-76% от всех ЖК (таблица). Для этого вида была обнаружена значительная концентрация специфических для диатомовых водорослей С16 ПНЖК (13% в исходной культуре), главной из которых являлась 16:3ю4. ЖК С18 присутствовали в минорных количествах. Отдельные классы липидов, ПЛ и ТАГ, различались по составу ЖК (рис. 3 и 4). ПЛ были определены как более ненасыщенные липиды, главным образом, за счет высокого содержания кислот 20:5ю3 и 16:3ю4, тогда как ТАГ в значительной степени были ацилированы на
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.