научная статья по теме ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИИ И ФИТОГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА У ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА В РЕЗУЛЬТАТЕ ЭКСПРЕССИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИИ И ФИТОГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА У ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА В РЕЗУЛЬТАТЕ ЭКСПРЕССИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 714-720

УДК 581.1

ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГИИ И ФИТОГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА У ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА В РЕЗУЛЬТАТЕ ЭКСПРЕССИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ

© 2004 г. Р. М. Абдеев, К. А. Мусийчук, И. В. Голденкова, Д. В. Сотченков, Г. Р. Салехи Джузани, А. К. Алявина*, Н. В. Загоскина*, Э. С. Пирузян

Институт общей генетики им. НИ. Вавилова Российской академии наук, Москва *Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Поступила в редакцию 24.07.2003 г.

Показано, что экспрессия бактериального гена термостабильной ß-1,4-глюканазы (целлюлазы) Clostridium thermocellum в трансгенных растениях табака приводит к значительным изменениям физиологии этих растений. В трансгенных растениях были изменены ростовые и морфологические показатели, а также баланс фитогормонов, по сравнению с контрольными растениями. Полученные результаты позволяют заключить, что трансгенные растения, экспрессирующие ген термостабильной бактериальной целлюлазы, являются удобными модельными системами для изучения роли ß-1,4-глюканаз в физиологических процессах растений.

Трансгенные растения - термостабильная бактериальная ß-1,4-глюканаза - ростовые показатели - фитогормоны

Эндо-Р-1,4-глюканазы или целлюлазы - это ферменты, гидролизующие полиглюканы, имеющие Р-1,4-гликозидные связи (целлюлоза, лихе-нан, ксилан и др.). Природными продуцентами целлюлаз являются многие организмы. Эндо-Р-1,4-глюканазы ряда бактерий и грибов преимущественно участвуют в деградации природной целлюлозы [1, 2]. Функции растительных целлюлаз шире и сложнее, чем просто деградация целлюлозы. В высших растениях синтезируется несколько изоформ целлюлазы, отличающихся между собой как по первичной последовательности, так и по участию в физиологических процессах растений [3]. Изоферменты целлюлаз различаются также по локализации в растительной клетке. Одни из них заякорены на плазматической мембране и действуют на внутренние слои клеточной стенки. Эти целлюлазы, предположительно, участвуют в процессах биосинтеза клеточной стенки с функцией редактирования синтезирующихся волокон целлюлозы либо коррекции сборки целлюлозо-гемицеллюлозной сети [4]. Другие целлюлазы секретируются в апопласт и реализуют свою ферментативную активность во внутренних и внешних слоях клеточной стенки.

Адрес для корреспонденции: Абдеев Рустам Муратович. 117809 Москва, ул. Губкина, 3. Институт общей генетики РАН. Факс: 07 (095) 132-89-62; электронная почта: roustam@vigg.ru

Они, как полагают, играют роль в катаболичес-ких процессах в клеточной стенке, и их активность значительно варьирует от невысокой и строго локализованной, связанной с процессами клеточного роста, до высокой и даже катастрофической, связанной с процессами клеточной гибели [4].

Экспрессия растительных целлюлаз находится под строгим контролем. Некоторые из них синтезируются только в момент созревания плодов или при опадании листьев [5]. Синтез других целлюлаз активируется в периоды роста клеток, что указывает на роль этих ферментов в сборке и коррекции полисахаридов первичной клеточной стенки растений [6].

Несмотря на интенсивные исследования свойств и функций целлюлаз в растениях, в настоящее время ничего не известно об их субстратах in vivo, а также о механизме их действия. Так, неясно, на что направлена их ферментативная активность в растениях - на волокна целлюлозы или иные Р-1,4-глюканы. Выяснение роли целлюлаз в процессах роста и развития растений затруднено, прежде всего, по причине наличия множества изоформ этих ферментов, которые отличаются как клеточной локализацией, так и индуцибель-ностью [3].

Существует ряд подходов к решению вышеуказанной проблемы. Один из них - экспрессия в растениях бактериальных генов термостабиль-

ных целлюлаз с активностями, аналогичными растительным ферментам и максимальными при высоких значениях температуры, при которых все растительные ферменты инактивируются. В пользу такого подхода (создание модельных трансгенных растений, экспрессирующих гены термостабильных ферментов) свидетельствуют данные, полученные в нашей лаборатории ранее [7, 8].

Термофильная бактерия С. гквгтосвИит является наиболее изученным среди целлюлозо-гид-ролизующих организмов [9, 10]. Эти анаэробные бактерии продуцируют ряд внеклеточных целлюлаз, в том числе и эндо-Р-1,4-глюканазу Е (цел-люлазу, Се1Е) [11], которая выбрана в качестве объекта наших исследований.

Недавно нами было показано, что в трансгенных растениях табака бактериальный ген термостабильной целлюлазы экспрессируется с сохранением активности и субстратной специфичности. Лидерный пептид экстенсина моркови осуществляет эффективную секрецию бактериального фермента в апопласт. При получении этих линий трансгенных растений нами было отмечено, что для регенерации растений из листовых дисков при трансформации экспрессионными векторами, которые содержат бактериальный ген целлюлазы, требуются повышенные концентрации фи-тогормона цитокинина в среде. Так, для образования побегов этих линий растений из каллуса требуется увеличение концентрации 6-БАП в 35 раз по сравнению с контрольными растениями [12]. Нами было высказано предположение, что трансгенные растения могут иметь измененный баланс фитогормонов, и, как следствие, измененную морфологию и ростовые показатели. В данной работе мы представляем данные об этих показателях у трансгенных растений, экспрессирующих ген бактериальной термостабильной целлюлазы.

МЕТОДИКА

Растительный материал. Были получены две линии трансгенных растений табака И1сойаиа tabacum (сорт Самсун), экспрессирующих бактериальную целлюлазу. Каждая линия состояла из 8 независимых трансформантов, несущих в своем геноме одну копию гена и проявляющих приблизительно одинаковый уровень активности целлюлазы в пределах линии. В одной линии, обозначенной нами как Се/Е-растения, экспрессия бактериального гена целлюлазы контролируется конститутивным промотором 35 Б РНК СаМУ, и бактериальный фермент локализован в цитозоле. Другая линия была обозначена нами как Ь-Се/Е-растения. В этой линии растений бактериальный ген целлюлазы, слитый с последовательностью, кодирующей лидерный пептид экстенсина моркови, также находится под контролем конститутив-

ного промотора 35S РНК CaMV, а термостабильная целлюлаза локализована в апопласте. В качестве контрольных растений (К-растения) использовали трансгенные растения табака, экспрессирующие только ген nptII. Такой контроль позволяет учесть возможное влияние экспрессии селективного гена nptII, который присутствовал в используемых для трансформации растений векторах.

Условия роста растений. Трансгенные растения черенковали и первоначально выращивали в стерильных условиях на агаризованной среде, содержащей половину дозы MC солей и 0.8% сахарозы в течение 4 нед. Затем их пересаживали в почву и переносили в теплицу, где рост продолжался при 25°C и 16-часовом освещении (2.5 клк). В результате этих манипуляций мы получали более однородный растительный материал. Через 30 сут после высадки в грунт регистрировали морфологические и ростовые показатели растений, после чего были собраны пробы для определения фитогормонов.

Количественное определение фитогормонов. Выделение эндогенных фитогормонов проводили из общей навески сухого растительного материала. Количественное определение фитогормонов проводили с помощью твердофазного имму-ноферментного метода в соответствии с [13, 14], используя реактивы от "Фармхиминвест" (Россия).

Статистическая обработка результатов. Все

представленные данные являются средними арифметическими из 3 независимых экспериментов, каждый из которых был проведен в 3-кратной биологической повторности.

Растительный материал фотографировали,

используя цифровой фотоаппарат Olympus C-1400XL (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Трансгенные растения табака обеих линий, экспрессирующие ген бактериальной целлюлазы, различались по ряду морфологических признаков как между собой, так и от контрольных растений. Следует отметить, что полученные нами независимые линии CelE- и L-CelE характеризовались схожими морфологическими изменениями внутри каждой линии, что не позволяет объяснить такие изменения сомаклональной вариабельностью. Морфологические изменения, сопутствующие экспрессии бактериального гена целлюлазы под контролем различных регуляторных элементов в растениях табака, представлены на рис. 1, а ростовые показатели суммированы в таблице.

Трансгенные растения, экспрессирующие ген бактериальной целлюлазы, отличались от контрольных растений и различались между собой по таким показателям как форма листовой пластинки, длина междоузлия, количество листьев,

приходящихся на один узел, и кустистость (рис. 1, таблица). Доля Се/Е-растений, имеющих после черенкования ветвящиеся побеги, составила 75%, а ¿-Се/Е-растений - 65%. Следует подчеркнуть, что у контрольных растений этот показатель не превышал 20%.

Длина междоузлия и количество листьев на узел отличались от контроля только у ¿-Се/Е-рас-тений (таблица). Эти растения характеризовались также и измененной формой листьев - их морщинистостью (рис. 2). Такие изменения отсутствовали как у Се/Е, так и у контрольных растений. Кроме того, только для растений линии ¿-Се/Е отмечается видоизменение кончика листа - он был закруглен, в отличие от заостренной формы характерной для кончика листа контрольных и Се/Е-растений.

Мы также провели сравнительное исследование таких показателей роста и развития растений, как длина основного побега, фаза роста, старение, прочность стебля, площадь листьев нижнего, среднего и верхнего ярусов. Однако по этим показателям трансгенные растения обеих линий не отличались достоверно от контрольных растений (данные не приводятся).

Морфологические особенности трансгенных растений линий Се/Е и ¿-Се/Е позволили нам

предположить, что эти растения могут иметь измененный фитогормональный статус. Для проверки этого предположения был проведен сравнительный анализ содержания ауксина и цитоки-нинов во всех линиях растений (рис. За). Оказалось, что фитогормональный статус Се/Е- и ¿-Се/Е-растен

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком