== РАДИАЦИОННАЯ БИОХИМИЯ =
УДК [57+61]::539.1.04:614.876
ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЛИПИДОВ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ
СПУСТЯ МЕСЯЦ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В МАЛЫХ ДОЗАХ ПЕРЕМЕННОЙ МОЩНОСТИ © 2012 г. М. А. Климович, М. В. Козлов, Л. Н. Шишкина*
Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва
Исследованы параметры физико-химической системы регуляции перекисного окисления липидов печени самок беспородных мышей в осенний и весенне-летний сезоны до и спустя месяц после воздействия рентгеновского излучения в дозах менее 1.5 мГр переменной мощности. Наиболее существенное влияние величины исходного показателя оказывают на изменение индекса печени, относительного содержания фосфатидилхолина и лизоформ в фосфолипидах печени мышей после воздействия рентгеновского излучения. Достоверное уменьшение и существенное влияние динамики мощности дозы в процессе облучения выявлено для мольного отношения [стерины]/[фосфолипи-ды], отношения фосфатидилхолин/фосфатидилэтаноламин и сумм более легкоокисляемых фракций к более трудноокисляемым фракциям фосфолипидов. Экспериментальные данные свидетельствуют о сложном, нелинейном характере биологических эффектов рентгеновского излучения в малых дозах переменной мощности.
Рентгеновское излучение, малые дозы, переменная мощность дозы, печень мышей, перекисное окисление липидов, фосфолипиды, холестерин.
Биологические последствия воздействия ионизирующей радиации в малых дозах на организм до сих пор один из наиболее дискуссионных разделов радиобиологии. Отсутствие четко выраженных радиобиологических последствий облучения животных в малых дозах диктует необходимость поиска показателей, изменения величин которых позволили бы оценить состояние метаболизма сложной системы в целом.
В ряде работ показана высокая чувствительность параметров физико-химической системы регуляции перекисного окисления липидов (ПОЛ) к действию повреждающих факторов, в том числе и действию радиации в малых дозах [1—3]. Однако радиобиологический ответ на воздействие рентгеновского излучения (РИ) в малых дозах будет определяться функциональным состоянием мембран, состав и физико-химические свойства липидов которых существенно зависят от многих факторов: возраст, сезон, характер питания [4, 5]. Показано, что параметры системы регуляции ПОЛ, такие как состав и антиокислительная активность липидов, в частности, оказывают влияние как на соотношение повреждения ДНК и мембраны, так и на репарацию мембран после воздействия РИ в малых дозах [3, 6]. Гепа-
* Адресат для корреспонденции: 119334 Москва, ул. Косыгина, 4, ИБХФ РАН; тел.: (495) 939-71-86; e-mail: shishki-na@sky.chph.ras.ru.
тоциты печени, выполняя одну из ключевых ролей в поддержании гомеостаза млекопитающих, обладают высокой чувствительностью к загрязнению окружающей среды [1, 7]. Однако данные литературы о влиянии РИ в малых дозах переменной мощности на липидный обмен в печени лабораторных животных практически отсутствуют. Кроме того, до сих пор является дискуссионным вопрос о том, что наиболее существенно для формирования последствий воздействия ионизирующих излучений в малых дозах в тканях млекопитающих с разным антиоксидантным (АО) статусом — сама доза облучения или ее мощность.
Цель работы — выявление изменений интенсивности ПОЛ и состава липидов печени мышей после воздействия низкоинтенсивного рентгеновского излучения в малых дозах переменной мощности в зависимости от исходных характеристик этих показателей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектами исследования были беспородные мыши (самки). Общее количество животных 97 особей, возраст мышей к моменту облучения 13 нед. Антиоксидантный статус и интенсивность ПОЛ в тканях мышей модифицировали проведением экспериментов в разные сезоны [5]: сентябрь—октябрь 2007 г. и май—июнь 2008 г. Мышей содержали в адекватных по массе тела группах (по
10 особей в каждой). Животных облучали в специальных контейнерах группами по 10 особей, располагая каждую мышь в отдельной ячейке с сохранением свободы движения. Животных облучали однократно в середине дня от 12.00 до 13.30 час., чтобы исключить влияние суточных колебаний антиокислительной активности липи-дов печени [5]. Источником рентгеновского излучения служил "СВЧ электронный циклотронный резонансный ускоритель", разработанный сотрудниками Института общей физики им. А.М. Прохорова РАН, устройство и принцип работы которого подробно описан в [8, 9]. Тормозное рентгеновское излучение электронов регистрировали детектором "2.5M2.5/3LP-X" фирмы "BYCRON". Отсутствие СВЧ — компоненты в зоне облучения контролировали с помощью дозиметра.
Интенсивность РИ источника с течением времени падает. Это связано с изменением давления при непрерывной откачке камеры. Интенсивность рентгеновского излучения источника достигала максимальной мощности дозы излучения в течение первых минут работы. Доза и мощность дозы рентгеновского облучения мышей фиксировались в каждом опыте с автоматической регистрацией результатов на компьютере. Типичные кривые изменения мощности дозы во время облучения представлены в [9].
Контрольными животными служили мыши из той же партии, с ними проводились те же манипуляции, что и с опытными, исключая воздействие РИ. Забой опытных и контрольных мышей производили в 2007 г. спустя 30, а в 2008 г. — спустя 31 сут после облучения. Кроме того, изучены показатели ПОЛ в печени исходных групп мышей, забой которых осуществляли в начале экспериментов. Мышей забивали декапитацией с 10 до
11 час. утра, чтобы исключить суточные колебания значений изученных показателей. Варианты экспериментов суммированы в табл. 1.
Печень сразу после забоя животных помещали в бюксы, охлаждаемые льдом. Липиды выделяли по методу Блая и Дайера в модификации Кейтса [10]. Разделение фосфолипидов (ФЛ) на фракции осуществляли методом тонкослойной хроматографии по Шталю [11]. Использовали силикагель типа G "Sigma" (USA), стеклянные пластины размером 90 х 120 мм. Разделение ФЛ на фракции проводили в предварительно насыщенной хрома-тографической камере в системе растворителей: хлороформ—метанол—ледяная уксусная кислота— дистиллированная вода в объемном соотношении 12.5 : 7.5 : 2 : 1. Пластины проявляли в парах йода. Количественный анализ фракций ФЛ проводили на спектрофотометре "КФК-3" (Россия) при длине волны 800 нм по образованию фосфорномолибденового комплекса в присут-
Таблица 1. Варианты экспериментов
Показатель № группы
1 2 3 4 5
Сентябрь—октябрь 2007 г.
Возраст, нед 13 17 17 17 17
Доза облучения, мГр 0 0 0.25 0.44 0.45
Число мышей в группе 10 5 10 10 10
Май- июнь 2008 г.
Возраст, нед 13 17 17 17 17
Доза облучения, мГр 0 0 0.88 0.9 1.43
Число мышей в группе 10 5 10 10 10
ствии аскорбиновой кислоты. Более подробно описание метода дано в [12]. Отношение сумм более легкоокисляемых фракций к сумме более труд-ноокисляемых фракций ФЛ (ЕЛОФЛ/ЕТОФЛ) рассчитывали по формуле
ЕЛОФЛ/ЕТОФЛ = (ФИ + ФС + ФЭ + ФГ +
+ КЛ + ФК)/(ЛФФЛ + СМ + ФХ),
где ФИ — фосфатидилинозит, ФС — фосфатидил-серин, ФЭ — фосфатидилэтаноламин, ФГ — фос-фатидилглицерин, КЛ — кардиолипин, ФК — фосфатидная кислота, ЛФФЛ — лизоформы ФЛ, СМ — сфингомиелин, ФХ — фосфатидилхолин. В ФЛ печени отдельных особей были выявлены дополнительные фракции ФЛ, которые, вероятно, являются окисленными видами ФХ (ФХ1) и ФЭ (ФЭ1) в очень незначительных количествах. Содержание стеринов в липидах печени определяли спек-трофотометрически на спектрофотометре "КФК-3" (Россия) при длине волны 625 нм по методу [13]. Для построения калибровочной прямой использовали холестерин "Serva" (США). Интенсивность ПОЛ оценивали по содержанию продуктов, взаимодействующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты, ТБК-АП), анализ которых проводили с добавлением в среду инкубации 10 мкл 0.01%-ного спиртового раствора ионола, измеряя оптическую плотность при X = = 532 нм [14]. Содержание белка определяли с помощью модифицированного микробиуретового метода (спектрофотометрия при X = 540 нм) [15]. Содержание ТБК-активных продуктов выражали в нмоль/мг белка. Индекс печени рассчитывали как отношение массы органа в мг к массе тела в г и выражали в промиллях (%с). Количество гидроперокси-дов в липидах измеряли методом йодометрического титрования (ГОСТ 26583-85). Об антипероксидной активности (АПА) липидов, т.е. способности липи-дов разлагать гидроперекиси, судили по разности концентрации гидропероксидов в окисленном метилолеате до и после прибавления к нему липидов, выделенных из печени, отнесенной к 1 г
Таблица 2. Морфометрические характеристики групп мышей и среднегрупповые значения показателей пере-кисного окисления липидов в разных вариантах экспериментов
№ группы
1 2 3 4 5
Сентябрь—октябрь 2007 г.
Масса мыши, г 25.7 ± 0.5 29.5 ± 0.6* 32.1 ± 0.2*** 31.4 ± 0.3** 30.8 ± 0.4
Индекс печени, %% 51 ± 2 42 ± 2.5'" 46 ± 2*** 55 ± 1*** 47 ± 4*
Доля ФЛ в составе общих липидов, % 39.9 ± 3 23 ± 2" 24 ± 3 27 ± 3 26.5 ± 2
[ТБК-АП], нмоль/мг белка 0.068 ± 0.007 0.032 ± 0.003 0.033 ± 0.003 0.029 ± 0.002 0.03 ± 0.002
АПА, ммоль/г глипидов 2.7 ± 0.3 2 ± 0.7 2.2 ± 0.5 1.7 ± 0.2 2.2 ± 0.3
Май-июнь 2008 г.
Масса мыши, г 25.9 ± 0.4 32 ± _ 2-.. 28.9 ± 0.9 31 ± 0.4 31.3 ± 0.8
Индекс печени, % 57 ± 2" 47 ± 2" 48 ± 1 48 ± 1 51 ± 2***
Доля ФЛ в составе общих липидов, % 50 ± 3" 41 ± 4" 38 ± 2 53 ± 4 51 ± 2*
[ТБК-АП], нмоль/мг белка 0.03 ± 0.003" 0.014 ± 0.0008" 0.025 ± 0.0025* 0.023 ± 0.002* 0.018 ± 0.002
АПА, ммоль/г глипидов 1.9 ± 0.2* 2.7 ± = 0.3" 2.6 ± 0.3 2.9 ± 0.3 3.1 ± 0.2
Примечание. Здесь и далее отличия от возрастного контроля достоверны: *р < 0.05; **р < 0.01; ***р < 0.001. Различия между контрольными группами мышей достоверны: * р < 0.05; ** р < 0.01; *** р < 0.001.
липидов [16]. Все измерения проводили для каждого животного индивидуально. Экспериментальные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики [17] и с помощью компьютерного пакета программ KINS [18]. На рисунках и в таблицах данные представлены в виде среднеарифметических значений с указа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.