ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 6, с. 887-895
УДК 581.1
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АКВАПОРИНОВ В КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАНАХ Mesembryanthemum erystallinum ПРИ ПЕРЕХОДЕ С С3-ТИПА ФОТОСИНТЕЗА НА САМ
© 2004 г. К. Н. Божко, И. М. Жесткова, М. С. Трофимова, В. П. Холодова, Вл. В. Кузнецов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 22.12.2003 г.
Методом вестерн-блот-анализа определено содержание изоформ аквапоринов MIP A, MIP B и MIP C в клеточных мембранах, изолированных из корней и листьев Mesembryanthemum erystallinum с С3-и САМ-типом фотосинтеза. Для тех же мембран оценена величина осмотической водной проницаемости по скорости осмотического сжатия везикул, регистрируемой как изменение интенсивности светорассеяния методом остановленного потока. Клеточные мембраны, представленные плазма-леммой и фракцией, обогащенной тонопластом, получали разделением микросом в двухфазной полимерной системе. Переход растений с С3-типа фотосинтеза на САМ был индуцирован или онтогенетическим развитием, или засолением. Все три исследованные изоформы присутствовали в плазматических мембранах как корней, так и листьев С3-растений. В САМ-растениях, независимо от фактора, индуцирующего переход, существенно снижалось их содержание в мембранах листьев, в то время как их содержание в корнях практически не изменяется. Величина осмотической водной проницаемости мембран, изолированных из корней и листьев САМ-растений, была в 2-3 раза ниже, по сравнению с С3-растениями. Предполагается, что в разных органах и тканях M. ^stal^num регуляция одних и тех же изоформ аквапоринов может осуществляться разными путями.
Mesembryanthemum erystallinum - CAM - корни - листья - трансмембранный транспорт воды - ак-вапорины - изоформы
Метаболизм органических кислот по типу тол-стянковых (САМ) является водосберегающим механизмом фотосинтеза, обеспечивающим ассимиляцию С02 и резко повышающим адаптационный потенциал растений в условиях экстремально засушливого климата. Эффективность использования воды САМ-растениями превышает аналогичный показатель С3-растений в 5-10 раз [1, с. 385; 2]. Формирование САМ может носить конститутивный, стресс-индуцируемый или онтогенетически регулируемый характер. Особый интерес для исследования механизмов выживания и адаптации растений в условиях низкого водного потенциала (^w) представляют факультативные САМ-растения, такие, например, как хрустальная травка (Mesembryanthemum erystallinum L., сем. Aizocacea). Этот вид проявляет генетически детерминированный переход с С3-типа фотосинтеза
Сокращения: БСА - бычий сывороточный альбумин; -водный потенциал.
Адрес для корреспонденции: Божко Кира Николаевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 07 (095) 977-80-18, электронная почта: pmembrane@ippras.ru
на САМ, который реализуется в условиях стресса, а также на поздних стадиях генеративного развития [3].
Выживание M. erystallinum при засухе и интенсивном засолении предполагает функционирование, помимо САМ, целого комплекса фундаментальных адаптивных механизмов, направленных на поддержание водно-солевого статуса растения. Эти механизмы включают запасание и реутилизацию воды, компартментацию избыточных ионов в специализированных клетках, регуляцию состава внутриклеточной среды окружения макромолекул и ингибирование транспирации, поддержание низкого осмотического потенциала клеточного содержимого, а также сокращение продолжительности онтогенеза [4, 5]. При низком значении Tw почвенного раствора адаптивные реакции растения направлены, прежде всего, на восстановление направления градиента Tw от питательного раствора к листьям, без чего поглощение воды корневой системой невозможно. Восстановление понизившегося в результате засоления градиента Tw от почвы к растению может быть достигнуто за счет осморегуляции. Основным путем осморегуляции выступает механизм аккумуляции ионов, который активно функцио-
нирует в растениях хрустальной травки [4, 6]. Для восстановления внутриклеточного баланса осмотического потенциала между вакуолью и цитозо-лем хрустальная травка синтезирует и аккумулирует в цитозоле так называемые совместимые ос-молиты, такие как пролин и сахароспирты, прежде всего пинит [5, 7]. Результатом аккумуляции неорганических ионов, синтеза органических осмолитов и уменьшения клеточного объема является снижение осмотического потенциала клеточного сока листьев растений в условиях длительной засухи и засоления. Однако функционирование перечисленных выше механизмов адаптации, направленных на осморегуляцию и эффективное расходование воды при стрессе, может быть эффективным только при согласованности изменений внутриклеточной концентрации осмотиков и интенсивности трансклеточных потоков воды, контролируемых на уровне мембран.
По мнению ряда авторов [8-11], мембраны являются одним из важнейших пунктов в иерархии систем, регулирующих формирование ответной реакции растения на водный дефицит, в силу присущей им способности регулировать свою водную проницаемость. Такую способность связывают с наличием в их составе интегральных белков-ак-вапоринов, функционирующих как водные каналы и облегчающих пассивный перенос молекул воды через мембраны [12]. На основании полученных ранее данных полагают, что факторы, контролирующие гидравлическую проницаемость клеточных мембран, играют важнейшую роль в осморегуляторных процессах, связанных с адаптацией к осмотическому стрессу [13-15]. Тем не менее, предположение о важной роли регуляции водной проницаемости мембран при адаптации растений к стрессорным условиям пока не имеет достаточных экспериментальных доказательств. Относительное содержание аквапоринов в мембранах, удельная водная проводимость индивидуальных изоформ, а также вероятность нахождения водной поры в открытом или закрытом состоянии, могут быть ключевыми факторами, определяющими интенсивность трансмембранного переноса воды в растениях. Ранее мы показали, что водная проницаемость плазмалеммы и то-нопласта, изолированных из листьев растений M. crystallinum, значительно снижается с возрастом растений и их переходом с С3-типа фотосинтеза на САМ [16]. Причиной такого снижения водной проницаемости мембран в процессе стресс-индуцируемого и онтогенетически-регу-лируемого формирования САМ могло быть понижение в них уровня аквапоринов. Для проверки данного предположения в настоящей работе была проведена оценка содержания в изолированных клеточных мембранах трех изоформ аквапоринов - MIP A, MIP B и MIP C, гомологичных ак-вапоринам плазмалеммы.
МЕТОДИКА
Mesembryanthemum crystallinum L. выращивали в камере фитотрона при температуре 23-25°С и относительной влажности воздуха 55% в дневное время суток. Ночью температуру и влажность воздуха поддерживали на уровне15-17°С и 70%, соответственно. Фотопериод составлял 12 ч при освещенности 350 ± 50 мкмоль/(м2 с). Двух—трехнедельные проростки пересаживали в сосуды с непрерывно аэрируемым питательным раствором Johnson, модифицированным по Winter [17]. Питательный раствор меняли каждые 5 сут. Часть 5-недельных растений подвергали солевому стрессу путем однократного добавления в питательный раствор 400 мМ NaCl и их последующего выращивания в этих условиях в течение 3 ч или 2 нед. Контрольные растения росли в отсутствие NaCl.
Об индукции и развитии САМ судили по изменению характерной суточной динамики титруемой кислотности клеточного сока. Для этого вод-но-метанольную вытяжку клеточного сока из 23 высечек (диаметром 1 см) 3-й пары первичных листьев, полученную вечером (20:00) или утром (8:00), титровали 10 мМ раствором NaOH до рН 7.0 ± 0.05. Расчет содержания протонов [Н+] проводили с учетом массы свежей ткани. Согласно Winter с соавт. [18], основной вклад (70-80 %) в кислотность клеточного сока дает малат. Величину ночного накопления малата рассчитывали по формуле Д[Н+] = [Н+]утро - [Н+]вечер.
Для получения микросомальных мембран корни или первичные листья гомогенизировали в среде, содержавшей 300 мМ сахарозу, 100 мМ Трис-НС1 (рН 8.0), 10 мМ ЭДТА, 5 мМ метаби-сульфит калия, 5 мМ дитиоэритритол, 5 мМ фенил-метилсульфонилфторид и 0.6%-ный поливинил-пирролидон. Микросомальные мембраны получали дифференциальным центрифугированием гомоге-ната и далее разделяли их, как описано ранее [16], в водной двухфазной полимерной системе (6.2%-ный декстран Т500-6.2%-ный ПЭГ 3350) на две мембранные фракции, одна из которых содержит плазмалемму, а другая обогащена тонопластом. Мембраны из фазовой разделяющей системы разводили средой А, содержавшей 0.3 М сахарозу, 10 мМ МЕБ-бис-трис-пропан (pH 7.2), 0.5 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиоэритритол, и осаждали центрифугированием (100000 g, 30 мин). Осадки суспендировали в среде А и хранили при -70°С. Содержание белка в препаратах определяли методом Bradford [19] с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве стандарта и 0.05%-ного Тритона Х-100 для солю-билизации мембранных белков. Чистоту мембранных фракций оценивали по активности специфических маркерных ферментов [20].
Для измерения водной проницаемости мембран везикулы, суспендированные в среде А, размораживали и смешивали с двукратным объемом среды Б, содержавшей 10 мМ MES-бис-трис-про-пан (pH 7.2) и 1 мМ MgSO4, что приводило к перезаполнению везикул средой Б и, соответственно, уменьшению внутривезикулярной концентрации сахарозы до 100 мМ. Средой Б, дополненной 100 мМ сахарозой, суспензию разбавляли до содержания в ней белка 100-250 мкг/мл. Для оценки водной проницаемости мембран полученную суспензию смешивали с гипертонической средой Б, содержавшей 500 мМ сахарозу, и методом остановленного потока регистрировали кинетику изменения интенсивности светорассеяния при 515 нм, отражающую временной ход осмотического сжатия везикул. Осмотическое сжатие везикул в гипертонической среде регистрировали с помощью приставки к спектрофотометру Hitachi-557 ("Hitachi", Япония). Давление на поршни, приводящее в движение смешиваемые растворы, составляло 3 кг/м2. Измерения вели при 17°С. Кинетические кривые, характеризующие временной ход светорассеяния ве
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.