ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 4, с. 276-284
= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.19:577.13
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ И СОСТАВА ФЕНОЛКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В ХОДЕ РОСТА КЛЕТОК КСИЛЕМЫ СОСНЫ
ОБЫКНОВЕННОЙ
© 2011 г. Г. Ф. Антонова, Т. В. Железниченко, В. В. Стасова
Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, 660036 Красноярск, Академгородок E-mail: institute_forest@ksc.krasn.ru Поступила в редакцию 23.06.09 г.
Окончательный вариант 22.03.10 г.
Содержание и состав фракций спирторастворимых фенолкарбоновых кислот (ФК) изучали в связи с ростом клеток ксилемы в ходе образования годичного прироста древесины в стволах сосны обыкновенной. Клетки камбиальной зоны, двух этапов роста растяжением и начала вторичного утолщения (до лигнификации) в период формирования ранней ксилемы последовательно выделялись из отрезков ствола 25-летних деревьев сосны при постоянном анатомическом и гистохимическом контроле. Содержание свободных и связанных форм, а в их составе простых и сложных эфиров ФК, извлеченных из тканей 80%-ным этанолом, рассчитывали на сухой вес и на клетку. Содержание, соотношение фракций и состав кислот значительно меняются от камбиальной зоны до начала вторичного утолщения трахеид, и характер варьирования зависит от метода расчета. В расчете на клетку количество свободных и связанных ФК, а в их составе сложных и, особенно, простых эфиров, увеличивалось на первом этапе роста растяжением, снижалось на втором и вновь возрастало в начале отложения вторичной стенки. В зависимости от стадии развития клеток пул связанных кислот превышал пул свободных в 2—5 раз. В составе свободных оксикоричных кислот доминировали синапо-вая и феруловая кислоты. Состав и содержание оксикоричных кислот в простых и сложных эфирах тоже зависели от этапа развития клеток. В камбии основными агликонами в простых эфирах были п-кумаровая и синаповая, на других стадиях развития — синаповая и кофейная. Сложные эфиры камбия включали главным образом п-кумаровую кислоту, а других этапах развития — синаповую и феруловую кислоты. На первых стадиях роста бензойная кислота входила в состав главным образом в сложные эфиры. Пул этих эфиров от первой фазы роста к началу утолщения стенок уменьшался. Соответственно повышался уровень свободной бензойной кислоты.
Ключевые слова: фенолкарбоновые кислоты, фракции, состав, камбиальная зона, рост растяжением, вторичное утолщение, ранняя ксилема, Pinus sylvestris.
В росте и развитии растений важную роль играют такие продукты вторичного метаболизма, как фенолкарбоновые кислоты (ФК) и, в частности, оксибензойные и оксикоричные, а также их производные (Запрометов, 1993). В растениях оксикоричные кислоты (п-кумаровая, кофейная, феруловая, синаповая) обладают разными физиологическими функциями. Опосредуя действие таких ростовых веществ, как цитокинин, производные ФК контролируют деление и расширение клеток (Teutonico et al., 1991). Благодаря природным анти-оксидантным свойствам, эфиры оксикоричных кислот, в частности, хлорогеновая кислота, могут защищать липиды от перекисного окисления in vivo (Rice-Evans et al., 1997). По некоторым данным ок-сикоричные кислоты обладают антимутагенными свойствами (Ferguson et al., 2003) и могут влиять на апоптоз клеток (Tamagnon et al., 1998; Ванюшин и др., 2004, Дубравина и др., 2005). Поскольку ФК в
свободной форме потенциально токсичны для клетки, они находятся в растениях главным образом в связанной форме и конъюгированы с сахара-ми или органическими кислотами.
Помимо участия в синтезе лигнина, фенилпро-пановые единицы которого являются производными оксикоричных кислот, ФК используются в росте клеток и создании структуры первичных клеточных стенок. Димеризованные оксикоричные кислоты, такие как диферуловая кислота, могут поперечно связывать как сами пектины, так и пектины с другими нецеллюлзными полисахаридами и протео-гликанами (Fry, 1993, 2004; Waldron et al., 1997; Антонова, 1999).
Тесно связанные с компонентами клеточных стенок ФК выделяются из ткани только растворами щелочи или кислоты, разрушающими эти связи, и такой метод их выделения используется в большин-
стве работ, посвященных изучению ФК в растениях, например, в двудольных (Lozovaya et al., 1999). Несвязанные с компонентами стенок бензойные и оксикоричные кислоты и их производные извлекаются такими органическими растворителями как спирты или их водные растворы.
Уровень таких спирторастворимых фенолов зависит от степени дифференциации тканей, как это было обнаружено в каллусных культурах чайного растения (Загоскина и др., 1994) и при развитии зерен ржи (Weidner et al., 2000). Было показано, что общих фенольных соединений, а в их составе ФК в расчете на сухой вес, больше в начале развития, чем на конечных стадиях созревания (Weidner et al., 2000).
ФК и их роль в процессе роста изучалась в основном на однодольных и двудольных растениях. Значительно меньше исследований было посвящено ФК в связи с ростом древесных растений, в том числе хвойных. Исследуя образование ранних и поздних трахеид в стволах лиственницы сибирской, мы нашли, что содержание свободных и связанных ФК, а также их состав, зависит как от стадии дифференциации клеток, так и типа (ранней или поздней) ксилемы, которая формируется в данный период вегетации (Чаплыгина, 2007). Изменение фракционного состава и содержания ФК в ходе роста трахеид лиственницы коррелировало с содержанием и соотношением аскорбиновой (АК) и дегид-роаскорбиновой (ДАК) кислот (Антонова и др., 2005). В тканях растений от соотношения этих кислот, которое определяет их окислительно-восстановительный потенциал, зависит процесс сшивания полисахаридов (Zarra et al., 1999) и полимеризация монолигнолов — предшественников лигнина (Taka-hama, 1993, 1994). Считают, что аскорбиновая кислота регулирует количество коричных кислот доступных действию пероксидаз, присутствующих в стенке, и пока аскорбат доступен для перекиси водорода, процессы сшивки и полимеризации в стенке тормозятся (Takahama, Oniki, 1997). Например, зоне активного роста корней огурца соответствует повышенное содержание АК и определенное соотношение АК/ДАК, которое в апопласте и симпла-сте изменяется вдоль оси роста корня (C0rdoba-Pe-dregosa et al., 2003; Ros-Barcel0 et al. 2006). На гипо-котилях сосны было показано, что высокое содержание АК благоприятствует их росту, но с уменьшением ее количества вдоль оси рост гипоко-тилей тормозится (Sánchez et al., 1997; Zarra et al., 1999). Предполагают, что ограничение роста клеток гипокотилей происходит в результате образования диферуловых мостиков между полисахаридами клеточной стенки под действием пероксидаз, присутствующих в стенке.
Мы изучали содержание и соотношение аскор-бата и дегидроаскорбата в растущих клетках ксилемы при образовании годичного слоя в стволах дере-
вьев сосны обыкновенной (Антонова и др., 2009). Было найдено, что каждая из стадий дифференциации клеток характеризуется определенным уровнем АК и ДАК. Такие изменения в метаболизме должны влиять на содержание и фракционный состав ФК, а это, в свою очередь, на ростовые процессы. Поэтому следующим этапом исследования явилось изучение содержания и состава свободных и связанных форм ФК.
В работе изучались спирторастворимые ФК, их фракционный состав и содержание оксикоричных кислот на этапах образования и роста ранних трахеид при формировании годичного прироста древесины в стволах сосны обыкновенной.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом исследования служили слои клеток развивающегося годичного слоя ксилемы, полученные в начале июня из стволов двух интактных 20— 25 летних деревьев сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), растущих в посадках Погорельской экспериментальной базы Института.
Стволы распиливали по мутовкам, удаляли кору, непроводящую и проводящую флоэму, и методом микрорассечения с помощью скальпеля собирали слои клеток, постоянно контролируя гистохимиче-ски стадию их развития, как было сделано ранее (Антонова и др., 2009). В качестве красителей применяли крезил-виолет, позволяющий, благодаря метахромазии, визуально определять принадлежность клеток к фазам дифференциации (Антонова, Шебеко, 1981), а также реактив Визнера (флоро-глюцин — соляная кислота) для определения начала лигнификации.
Были получены клетки камбиальной зоны (Кам), зоны роста растяжением и начала вторичного утолщения. В начале июня, когда идет образование ранней ксилемы, зона роста растяжением содержала, как обычно в это время сезона, достаточное большое (до 10—14) число клеток, что позволило разделить ее на две подзоны. Одна из них прилегала к камбиальной зоне, т.е. клетки ксилемы находились в первой фазе роста радиального диаметра (Рост1), а вторая часть прилегала к зоне отложения веществ вторичной стенки и находились соответственно во второй фазе (Рост2). В тот же период развития в формирующемся годичном слое присутствовали клетки первого этапа вторичного утолщения, в которых отмечалось отложение вторичной стенки, но лигнификация не наблюдалась (D1). Начало роста клеток растяжением отмечали по видимому увеличению радиальных размеров клеток, начало отложения веществ вторичных стенок — по появлению окаймления пор, что характерно для начала отложения вторичной стенки трахеид (Murmanis, Sachs, 1969).
Полученный материал по мере отбора погружали в этанол (конечная концентрация спирта была не более 80%), взвешивали и хранили в холодильнике до анализа. Вес полученных образцов определяли с учетом веса 96% спирта, использованного для фиксации. Одновременно отбирали навески ткани на мацерацию и для определения влажности ткани. Мацерацию тканей проводили по методикам, примененным в работе (Москалева, 1958; Одинцов и др., 1967). Число клеток в мацерате подсчитывали с помощью камеры Фукса-Розенталя.
Анализ материала
Суспензию, полученную при фиксации материала, фильтровали, твердые остатки растирали в ступке с жидким азотом и экстрагировали 80% водным этанолом при комнатной температуре с периодическим помешиванием и сменой растворителя через 12 часов до отрицательной реакции на углеводы (Dubois et al., 1956). Фильтрат и экстракт объединяли и общий объем раство
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.