ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 3, с. 325-332
УДК 581.1
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ НЕАКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ ВТОРОЙ ФОТОСИСТЕМЫ У ХЛОРЕЛЛЫ, ИНКУБИРУЕМОЙ В ТЕМНОТЕ И НА СВЕТУ
© 2004 г. Ю. К. Чемерис, Н. С. Корольков, Н. X. Сейфуллина, А. Б. Рубин
Кафедра биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 05.03.2003 г.
Инкубация в течение 20-24 ч в темноте при 37-38°С клеток водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick не вызывала подавления относительного выхода переменной флуоресценции хлорофилла (Fv/Fm), но сопровождалась увеличением относительного вклада медленной фазы (mFv) в кинетике нарастания Fv Присутствие йодацетамида, неметаболизируемого аналога глюкозы 2-дезокси-Б-глюкозы, ингибитора синтеза белка циклогексимида или снижение температуры темновой инкубации до 18-20°С предотвращало эффект нарастания вклада mFv. Освещение инкубированных в темноте клеток или добавление к ним в темноте 2-дезокси-Б-глюкозы приводило к восстановлению исходного уровня mFv. Во время роста хлореллы на свету вклад mFv обратимо снижался с уменьшением освещенности культуры водоросли и возрастал при исключении СО2 из барботажной смеси. Предполагается, что медленная фаза в кинетике нарастания Fv связана с функционированием фракции комплексов ФС II с дестабилизированным первичным хинонным акцептором электронов, а содержание таких комплексов регулируется в клетке в зависимости от редокс-состояния пластохинона.
Chlorella pyrenoidosa - переменная флуоресценция хлорофилла - пластохинон - QA - ФС II - регуляция
При исследовании влияния длительной темновой инкубации хлореллы на фотохимическую активность ФС II было обнаружено [1] значительное увеличение вклада медленной фазы (со временем нарастания несколько минут) в кинетике нарастания ¥т и переменной флуоресценции хлорофилла - Fv (где Fv = - ^0). Известно [2], что увеличение выхода флуоресценции хлорофилла в клетках фотосинтезирующих организмов от начального (темнового) до максимального - Ет уровня обусловлено накоплением реакционных центров (РЦ) ФС II с восстановленным первичным хинонным акцептором - 0А. В присутствии
диурона, ингибирующего реокисление 0А в реакциях дальнейшего переноса электронов на плас-
Сокращения: Fo - начальный и Fm - максимальный выходы флуоресценции хлорофилла; Fv - переменная флуоресценция хлорофилла; мFv - медленная и бFv - быстрая фазы в кинетике нарастания Fv; РЦ - реакционные центры; ЭТЦ -электрон-транспортная цепь; QA - первичный хинонный акцептор электронов; ПХ - пластохинон; 2ДБГ - 2-дезокси-Б-глюкоза; СГ - салицилгидроксамат.
Адрес для корреспонденции: Чемерис Юрий Константинович. 119899 Москва, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики. Факс: (095)939-11-15; электронная почта: chemeris@biophys.msu.ru
тохинон (ПХ), кинетика нарастания Fv отражает накопление РЦ ФС II с восстановленным QA, скорость которого определяется эффективностью процессов, протекающих только в ФС II [3]. Исходя из этого, можно заключить, что увеличение вклада медленной фазы в кинетике нарастания Fv у адаптированной к темноте хлореллы указывает на увеличение содержания комплексов ФС II с
низкой скоростью формирования 0А. По-видимому, у части комплексов ФС II длительная тем-новая инкубация приводит к нарушению электрон-транспортных реакций и(или) снижению эффективности процессов поглощения и миграции поглощенной энергии света к фотохимически активным РЦ.
Известно, что при переносе со света в темноту водорослей [4] и отдельных видов высших растений [5, 6] возрастает восстановленное^ хинон-ных акцепторов ФС II, с чем и может быть связано увеличение содержания комплексов ФС II с низкой скоростью восстановления QA. Накопление отрицательного заряда вблизи РЦ ФС II при восстановлении хинонов само по себе препятствует протеканию элементарного акта разделения зарядов в РЦ в результате возникновения электростатических эффектов [7], что, очевидно,
должно приводить к замедлению накопления QA. Помимо этого увеличение восстановленное™ пула пластохинона обратимо активирует протеин-киназы, которые, используя АТФ в качестве донора фосфатных групп, фосфорилируют белки тилакоидных мембран [8, 9] не только на свету, но и в темноте [10]. В результате фосфорилиро-вания белков ССК уменьшается размер светосо-бирающей антенны ФС II, поскольку часть фос-форилированного ССК отсоединяется от ФС II и мигрирует к ФС I [8]. Фосфорилированние D1- и Б2-белков ФС II приводит к их модификации, что, как предполагается [8, 9], сопровождается изменением констант связывания хинонных акцепторов. Дестабилизация первичного хинонного акцептора может быть, в частности, связана с изменением плотности поверхностного отрицательного заряда вблизи места посадки QA при фо-сфорилировании D2-белка. Естественно, что даже при высокой эффективности разделения зарядов в РЦ ФС II уменьшение константы связывания Qa с D2-белком может существенно снизить вероятность образования QA.
Если скорость формирования QA в комплексах ФС II действительно зависит от степени вос-становленности пластохинона (ПХ), то, очевидно, следует ожидать, что вклад медленной фазы в кинетике нарастания переменной флуоресценции будет изменяться с изменением степени восста-новленности ПХ не только при инкубировании водоросли в темноте, но и на свету. С целью проверки этого предположения в настоящей работе изучено изменение соотношения медленной и быстрой фаз в кинетике нарастания переменной флуоресценции у хлореллы при воздействиях, изменяющих восстановленность ПХ во время инкубации культуры водоросли как в темноте, так и на свету.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служила одноклеточная водоросль Chlorella pyrenoidosa Chick, термофильный штамм DMMSU S-39 из коллекции биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Водоросль выращивали в стеклянных термо-статируемых культиваторах, как описано ранее [1]. Перед экспериментами число клеток в культуре доводили до 5 млн. клеток/мл, разбавляя ее свежей средой.
Во время темновой инкубации клеток культуру водоросли продували воздухом. Кроме специально оговоренных случаев понижение температуры в культиваторе или внесение в культуру водоросли необходимых добавок производили сразу
после помещения водоросли в темноту. Снижение температуры в культиваторе от 37° до 20°С происходило за 10-15 мин.
В экспериментах с исключением С02 воздух перед поступлением в культиватор пропускали через 33%-ный раствор КаОИ и два последовательно соединенных сосуда с дистиллированной водой.
Светоиндуцированное выделение кислорода целыми клетками водоросли измеряли с помощью электрода Кларка в закрытой ячейке.
Начальный (темновой) уровень флуоресценции хлорофилла (^0) измеряли с помощью импульсного флуориметра при возбуждении слабой вспышкой света (50 мкс, 2 мкДж). Максимальный уровень флуоресценции, ¥т, измеряли при возбуждении той же вспышкой, но в присутствии 5 мкМ диурона и дополнительном освещении постоянным светом (7 Вт/м2). Относительный выход переменной флуоресценции рассчитывали, как отношение где ^ = ¥т -
На рисунках приводятся результаты характерных опытов, повторенных не менее пяти раз.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 представлены индукционные кривые флуоресценции хлорофилла хлореллы, возбуждаемой периодическими вспышками слабого света (50 мкс, 2 мкДж). Видно, что дополнительное освещение постоянным светом (7 Вт/м) водоросли, обработанной диуроном (5 мкМ), вызывало двухфазное увеличение выхода флуоресценции от темнового (Р0) до максимального (Рт) уровня, обусловленное [7] переходом РЦ ФС II в "закрытое" состояние в результате восстановления первичного хинонного акцептора - 0А. У клеток хлореллы, выращенных в оптимальных условиях на свету при 37°С (рис. 1, кривая 1), в кинетике нарастания переменной флуоресценции - ^у, (где ¥у = = ¥т - ¥0) преобладала быстрая фаза - б^у со временем нарастания менее 1 с. Медленная фаза -м¥у (время нарастания несколько минут) составляла не более 30-35%, соответственно величина отношения амплитуды медленной фазы к быстрой (м¥у/б¥у) равнялась 0.4-0.5. В кинетике темновой релаксации переменной флуоресценции также наблюдали две фазы, которые по характерному времени и относительной амплитуде соответствовали фазам нарастания.
Длительная (до 48 ч) темновая инкубация при 37°С культуры водоросли, предварительно выращенной на свету в оптимальных условиях, не снижала исходно высокую фотохимическую активность ФС II. Об этом свидетельствует тот факт, что интенсивность начального (¥0) и максимального (¥т) уровня флуоресценции хлорофилла изменялась незначительно (рис. 2) и, соответствен-
к к я к
о
о &
о ^
ч
л н о о к я к о к о н к К
к к а к
о
о &
о ^
ч л
¡3 о к я к о к о н к К
□—□-
А-*'
-СЮ 1
▼ - - тт3
2 4 6 8 Время, мин
Рис. 1. Индукционные кривые флуоресценции хлорофилла клеток хлореллы, измеренные в присутствии 5 мкМ диурона:
1 - контрольная культура, выращенная на свету (30 Вт/м2) при 37°С; 2 - культура, инкубированная в течение 20 ч в темноте при 37°С. Fo и Fm - соответственно, начальный (темновой) и максимальный уровень флуоресценции хлорофилла; мFv и бFv - соответственно, медленная и быстрая фаза нарастания переменной флуоресценции (м^ + бFv = Fv = Fm - Fo). Ломаными стрелками отмечено начало импульсного освещения клеток; прямыми стрелками, направленными вверх и вниз, отмечены моменты включения и выключения дополнительного постоянного света (7 Вт/м2); пунктирной стрелкой указан момент добавления диурона.
но, величина Fv/Fm, характеризующая квантовую эффективность раздела зарядов в РЦ ФС II [2], оставалась исходно высокой даже через 2 сут отсутствия освещения. Однако по мере темновой инкубации водоросли при 37°С значительно возрастал вклад медленной и, соответственно, уменьшался вклад быстрой фазы (рис. 2) в кинетике фотоиндуцированного нарастания Fv. В результате этих изменений через 48 ч темновой инкубации клеток основной становилась не быстрая, а медленная фаза фотоиндуцированного нарастания Fv, которая по амплитуде составляла более 70% от Fv (рис. 1). Такое увеличение относительного вклада медленной фазы в кин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.