РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 4, с. 414-422
^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ
РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК 599:539.1.047
ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ДНК СЕЛЕЗЕНКИ У МЫШЕЙ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ФЕНОЗАНА И ОБЩЕГО ВОЗДЕЙСТВИЯ у-РАДИАЦИИ В МАЛОЙ ДОЗЕ С МАЛОЙ МОЩНОСТЬЮ
© 2007 г. Г. П. Жижина*, Т. М. Заварыкина, Е. М. Миль, Е. Б. Бурлакова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, Москва
Исследовано влияние введения животным антиоксиданта фенозана в дозах 10-14 и 10-4 моль/кг и воздействия у-излучения в малой дозе 1.2 сГр на структурные характеристики ДНК селезенки и количество белка р53 в сыворотке крови мышей линий АКР и гибридов первого поколения F1(CBA х х С5^), различающихся по радиочувствительности и вероятности возникновения спонтанного лимфолейкоза. Изменение структурных характеристик ДНК (адсорбция на нитроцеллюлозных фильтрах, двунитевые разрывы) обнаружено у мышей каждой линии как после облучения, так и после введения фенозана в обеих дозах. Отмечено продолжительное действие этих факторов на структурные характеристики ДНК мышей АКР, согласующееся с их влиянием на выживаемость этих животных. При облучении мышей-гибридов F1 в дозе 1.2 сГр после введения фенозана в дозах 10-14 и 10-4 моль/кг обнаружено снижение количества двунитевых разрывов ДНК, указывающее на возможное защитное действие в отношении структуры ДНК этого антиоксиданта.
Мыши, линии АКР и F1(CBA х С57ВЬ), селезенка, ДНК, белокр53, ионизирующее излучение, малые дозы, фенозан.
Проблема эффектов действия ионизирующей радиации (ИР) в малых дозах на биологические объекты стала особенно актуальной после чернобыльских событий. Одним из наиболее вероятных отдаленных последствий облучения в малых дозах являются лейкозы [1]. Зависимость доза-эффект для низкоинтенсивного облучения по многим показателям разного уровня имеет нелинейный вид: в ряде случаев обнаружен ее немонотонный полимодальный характер, а масштаб изменений показателей метаболизма при низких мощностях облучения и малых дозах может быть сравним с масштабом изменений, вызванных облучением в дозах на порядок более высоких [2]. При изучении инверсии встроенных генов в хромосомах клеток селезенки мышей линии К 2 обнаружено, что равные по величине эффекты получаются при облучении в дозах порядка микрозивер-тов и десятка миллизивертов [3]. Это заставляет думать, что не существует безопасного уровня радиации, и даже очень малые дозы могут вызвать рак, а также нераковые заболевания [1].
Однако сведения о дозах низкоинтенсивной радиации, опасных для здоровья человека, немногочисленны и весьма противоречивы, как и данные о средствах, уменьшающих биологические эффекты таких излучений. В связи с этим пред-
*Адресат для корреспонденции: 117334 Москва, ул. Косыгина, 4, ИБХФ РАН; тел.: (495) 939-74-64; e-mail: zhizhi-na@sky.chph.ras.ru.
ставляет интерес дальнейшее изучение возможности нормализующего действия веществ этого рода (активных при поступлении в организм в малых дозах) на основе биофизических и биохимических показателей радиационных изменений в организме животных. Ранее нами получены данные об изменении в различных органах нормальных и лейкоз-ных мышей, подвергнутых воздействию ИР в малых дозах, конформации ДНК, содержания белка р53, активности ряда ферментов окислительно-восстановительной системы и гликолиза, а также структурных характеристик клеточных мембран [4-7]. Было показано, что облучение мышей-гибридов линии F1(CBA х С57В1) преимущественно в малых дозах (0.06-60 сГр) с малой мощностью дозы сопровождается появлением конформацион-ных изменений ДНК клеток селезенки, причем интенсивность ИР существенно влияет на характер дозовых зависимостей по этому показателю [2]. Облучение мышей линии АКР в дозе 1.2 сГр также приводит к изменению адсорбционных свойств ДНК селезенки [8].
Мыши линии АКР являются носителями вируса Т-лимфоцитарного лейкоза Гросса, который проявляется клинически в возрасте 5-6 мес. Развитие лейкоза у мышей линии АКР в возрасте 59 мес сопровождается существенными конформа-ционными изменениями ДНК, динамика которых в клетках тимуса и селезенки самок практически одинакова [4]. При параллельном измерении уровня содержания белка р53 в сыворотке крови
было зарегистрировано его повышение по сравнению с уровнем у низкораковой линии мышей [5]. Установленное в настоящее время молекулярное проявление действия ИР в малых дозах -возникновение в организме животных состояния окислительного стресса [6] - указывает на возможность предотвращения этого состояния путем введения антиоксидантов (АО). Фенозан принадлежит к этому классу соединений и проявляет антиоксидантные свойства даже в сверхнизких концентрациях. Защитное действие фенозана показано по интенсивности окислительных процессов в липидах при пролонгированном облучении мышей в дозе 15 сГр и введении препарата как до, так и после облучения [9]. При остром облучении в сублетальной дозе 150 сГр введение фенозана не защищало ДНК клеток костного мозга мышей линии СВА, но оказывало влияние на отдаленные пострадиационные изменения ДНК, проявляющиеся как радиационно-индуцированная нестабильность генома [10].
Цель настоящей работы - сравнительное исследование в динамике после облучения влияния воздействия низкоинтенсивной ИР в малой дозе на состояние структуры ДНК в клетках селезенки и содержание белка р53 в сыворотке крови у мышей разных линий, различающихся по вероятности возникновения спонтанного лейкоза (у животных высокораковой линии АКР и у низкораковых мышей-гибридов F1(CBA х С57В1), различающихся также и по чувствительности к облучению [11] ), изучение способности антиоксиданта фенозана модифицировать вышеуказанные радиационные эффекты, а также продолжительность такого действия. Уровень содержания белка р53 в сыворотке крови возрастает при развитии лейкозов и используется для характеристики лейкозов и других злокачественных процессов, и служит показателем системного ответа организма на различные воздействия [12,13].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Ранее было показано, что облучение самок линии АКР в дозе 1.2 сГр приводит к максимальному эффекту индукции лейкоза. В связи с этим опыты проводили на 3-месячных мышах-самках линии АКР и гибридах F1(CBA х С57В1) массой 1920 г. Каждой опытной группе мышей из 8-10 особей соответствовала контрольная группа. Животных облучали в дозе 1.2 сГр с инструментально измеренной мощностью дозы излучения 0.6 ± ± 0.06 сГр/сут на установке "ЭЦУ-100" с
энергией 150-200 КэВ.
Фенозан в виде водного раствора вводили мышам внутрибрюшинно 4-кратно до облучения, создавая концентрацию его в организме мышей не выше 10-14 или 10-4 моль/кг. Через 1 сут после 4-го введения животных помещали в поле источника
у-излучения и подвергали радиационному воздействию в течение 2 сут. ДНК выделяли сразу или через 30 сут после облучения. Для выяснения эффекта фенозана в контрольной серии без облучения выделение препаратов ДНК проводили на 2-е и 30-е сут после 4-го введения препарата.
Выделение препаратов ДНК из селезенки де-капитированных мышей осуществляли путем лизиса клеток 1%-ным водным раствором додецил-сульфата Na с 0.15 моль/л NaCl и 0.05 моль/л ЭД-ТА при рН 7.8 и последующего добавления к лизатам раствора 5 моль/л NaCl в количестве, обеспечивающем конечную концентрацию NaCl,
1 моль/л. Экстракцию белков проводили смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24 : 1), как в работе [14]. После осаждения ДНК этанолом и растворения осадка в стандартном солевом растворе в разведении 1 : 10 для удаления примесей РНК и белка проводили ферментативную обработку препаратов путем инкубации их при 37°С со 100 мкг/мл РНКазы ("Serva") в течение 60 мин и 150 мкг/мл протеиназы К ("Serva") в течение 90 мин с последующим удалением продуктов деградации РНК и белков. В результате содержание РНК и белков в очищенных препаратах ДНК не превышало 2-3%.
Определение двунитевых разрывов ДНК. Общепринятым тестом на наличие двунитевых разрывов (ДР) служила подвижность препаратов ДНК при электрофорезе в нейтральном 0.7% ага-розном геле при использовании буфера трис-бо-рат-ЭДТА в дистиллированной воде (ТВЕ, 70 ммол/л трис-НС1, 70 ммол/л Н3ВО4, 2 ммол/л
2 Na-ЭДТА, рН 8.2) [15]. Агароза и все реактивы были производства фирмы "Serva". В лунки гелей вносили по 0.5-1.0 мкг ДНК в 10 мкл буфера ТВЕ и для вхождения ДНК в гель подавали начальное напряжение 5 В/см в течение нескольких минут, а затем снижали его до 3.0 В/см при силе тока 40 мА.
Гели окрашивали раствором 0.5 мкг/мл бромистого этидия, фотографировали в проходящем УФ-свете через оранжевый светофильтр цифровой камерой "Nikon 3100", изображение переносили в компьютер и определяли площади полос на нем с помощью программы "Scion Image Beta 4.0.2". Среднее число двунитевых разрывов на молекулу ДНК N вычисляли по формуле: N = -ln{S/(S0 - S)}, где S0 -площадь всего пика, а S - его площадь, ограниченная ординатой максимума пика контрольной ДНК [16]. В качестве маркеров молекулярной массы ДНК использовали рестрикты ДНК фага X + EroRI (Serva). Средняя мол.м. препаратов ДНК клеток селезенки контрольных мышей Fx составляла 18 ± 2 МДа, селезенки контрольных мышей АКР соответственно 14 ± 2 МДа.
Полоса высокомолекулярной фракции ДНК была довольно узкой, а длина пути ее миграции
Адсорбция ДНК, отн. ед. 1.6
**
Щ Контроль
1-е сут □ 30-е сут
ДНК мышей Fx
ДНК мышей АКР
Рис. 1. Адсорбция на нитроцеллюлозных фильтрах ДНК клеток селезенки самок мышей-гибридов F1(CBA х С57В1) и мышей-самок линии АКР, выделенной на 1-е и 30-е сут после общего воздействия у-излучения в дозе 1.2 сГр. * р < 0.05 по отношению к 3-месячному интактному контролю соответствующей линии.
равнялась ~3 см, причем низкомолекулярные фракции ДНК полностью отсутствовали по всей длине 14 см геля. Увеличение количества ДР ДНК при строго стандартизованном процессе выделения возможно в результате гидродинамического сдвига при гомогенизации ткани, однако относительный вклад этого процесса, вероятно, одинаков в контрольных и опытных препаратах, поскольку электрофоретическая подвижность их почти не отличается, меняется лишь форма полосы.
Адсорбция
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.