научная статья по теме ИЗМЕНЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНЫХ ПРЕФЕРЕНДУМОВ ИЗОЛЯТОВ BEAUVERIA BASSIANA В ШИРОТНОМ ГРАДИЕНТЕ СИБИРИ И КАЗАХСТАНА Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗМЕНЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНЫХ ПРЕФЕРЕНДУМОВ ИЗОЛЯТОВ BEAUVERIA BASSIANA В ШИРОТНОМ ГРАДИЕНТЕ СИБИРИ И КАЗАХСТАНА»

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 574.23:575.174.015.3

ИЗМЕНЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНЫХ ПРЕФЕРЕНДУМОВ ИЗОЛЯТОВ БЕЛиУЕЯМ БЛ88!ЖЛ В ШИРОТНОМ ГРАДИЕНТЕ СИБИРИ И КАЗАХСТАНА

© 2012 г. В. Ю. Крюков1*, О. Н. Ярославцева1, Е. А. Елисафенко2, П. В. Митьковец3, Г. Р. Леднев3, Б. А. Дуйсембеков4, С. М. Закиян2, В. В. Глупов1

Институт систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск 2Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск 3Всероссийский институт защиты растений РАСХН, Санкт-Петербург—Пушкин 4КазНИИзащиты и карантина растений, Алматинская обл., Казахстан Поступила в редакцию 25.11.2011 г.

Проведено исследование мицелиального роста в диапазоне 5—35°С у 20 изолятов энтомопатогенно-го гриба Беаыуепа Ъашапа, выделенных в разных природных зонах Западной Сибири и Казахстана (от 65° до 43° с.ш.). Показано, что в направлении север—юг у популяций гриба достоверно увеличивается толерантность к повышенным температурам, что согласуется с хорошо выраженной широтной зональностью исследуемой территории. Изменение в холодовой активности культур прослеживалось менее четко, и не было достоверно скоррелировано с широтой местности и теплообеспечен-ностью регионов. Анализ геномного полиморфизма с использованием 7 мультилокусных межмикросателлитных ДНК-маркеров (КЗЯ) показал значительную обособленность степных толерантных к высокой температуре (35°С) изолятов гриба. Установлено, что именно степные изоля-ты характеризуются наиболее высоким уровнем вирулентности и способностью формировать дочернюю инфекцию на пораженных хозяевах при повышенных температурах (>30°С). Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее перспективным для контроля численности насекомых в условиях континентального и аридного климата, будет использование изолятов, выделенных в степных ландшафтах.

Ключевые слова: Беаыуепа, широтная зональность, температура, радиальный рост, вирулентность, геномный полиморфизм, адаптация, Ьерйпо(аг$а.

Анаморфный аскомицет Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. — один из наиболее распространенных в мире энтомопатогенных грибов, поражающий насекомых разных отрядов и активно использующийся для создания экологически безопасных инсектицидных препаратов [1—3]. Известно, что разные штаммы гриба могут проявлять разную устойчивость к лимитирующим абиотическим факторам среды и, в частности, повышенным или пониженным температурам [4—6]. Температурные границы мицелиального роста гриба лежат в пределах 5—37°С с оптимумом между 20—28°С [5—8]. Ряд авторов при изучении культур из разных географических регионов мира отмечали, что с понижением широты местности увеличивается термотолерантность популяций разных видов энтомопатогенных грибов [9—11] или, напротив, в более высоких широтах увеличивается их холодо-вая активность [6, 11]. Однако в других исследованиях подобных закономерностей не выявлено [5, 6, 12]. Недостаточно изученным остается во-

1 Автор для корреспонденции (e-mail: krukofr@mail.ru).

прос о генетической общности штаммов с определенными температурными преферендумами [13].

Равнинные территории Западной Сибири и Казахстана представляют собой уникальный регион для исследования температурных преференций микроорганизмов в градиенте север—юг, поскольку на данной территории идеально выражена широтная зональность [14] и, кроме того, данному региону свойственна высокая сохранность естественных ландшафтов [15].

Поиск штаммов энтомопатогенных грибов с разными температурными преференциями актуален и с прикладной точки зрения, поскольку в условиях континентального и аридного климата высокие температуры являются одним из основных лимитирующих факторов использования биопрепаратов на основе энтомопатогенных грибов [13]. Следует отметить, что рядом авторов показана взаимосвязь между устойчивостью к высоким или низким температурам у грибов, определяемой в различных тестах in vitro, и способностью инфицирования насекомых-хозяев при субоптималь-

Исследуемые изоляты Беаыуепа Ъавв1апа

№ п/п Изолят Природная зона Место изоляции Широта Долгота

1 N-2 Л-Т г. Надым 65°29' 72°31'

2 ЛБ-584 Л-Т 100 км Ю г. Салехард 65°23' 64° 42'

3 ЛБ-588 Л-Т 100 км Ю г. Салехард 65°23' 64° 42'

4 ЛБ-589 Л-Т 100 км Ю г. Салехард 65°23' 64° 42'

5 Во1-1 Л-С Новосибирская обл. г. Болотное 55°41' 84°22'

6 Во1-2 Л-С Новосибирская обл. г. Болотное 55°41' 84°22'

7 Во1-4 Л-С Новосибирская обл. г. Болотное 55°41' 84°22'

8 К-18 Л-С Новосибирская обл. с. Репьево 55°04' 83°31'

9 гь-17 Л-С Новосибирская обл. с. Жеребцово 55°06' 83°18'

10 В8-4 Л-С Новосибирская обл. с. Новососедово 54°37' 83°57'

11 1-2 Л-С Новосибирская обл. с. Бурмистрово 54°38' 82°47'

12 иш-3 С-С Новосибирская обл. г. Карасук 53°45' 77°42'

13 ВВК-1 С-С Новосибирская обл. г. Карасук 53°42' 78°10'

14 $аг-31 С-С Новосибирская обл. г. Карасук 53°41' 78°02'

15 $еш-2 С-С С-В Казахстан г. Семей 50°22' 80°22'

16 £еш-3 С-С С-В Казахстан г. Семей 50°22' 80°22'

17 ик-2 Ю-С Ю-В Казахстан, 70 км З г. Алматы 43°25' 75°50'

18 ик-4 Ю-С Ю-В Казахстан, 70 км З г. Алматы 43°25' 75°50'

19 ик-5 Ю-С Ю-В Казахстан, 70 км З г. Алматы 43°25' 75°50'

20 ик-6 Ю-С Ю-В Казахстан, 70 км З г. Алматы 43°25' 75°50'

Примечание. Л-Т — лесотундра, Л-С — лесостепь, С-С — северная (разнотравно-дерновинно-злаковая) степь, Ю-С — южная (опустыненная) степь.

ных для микромицетов температурных режимах [11, 16, 17]. Однако другие исследователи не выявили подобных тенденций [18].

В связи с этим, целью настоящей работы явилась оценка мицелиального роста в температурном диапазоне 5—35°С у изолятов Беаыуепа Ъазз1апа, выделенных в разных природно-климатических зонах Западной Сибири и Казахстана (65°—43° с.ш.), анализ их генетических различий, а также изучение вирулентных свойств культур при разных температурных условиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культуры грибов. В работе использованы 20 изолятов Беаыуепа Ъа5$1апа из коллекций энто-мопатогенных микроорганизмов Института систематики и экологии животных (ИСиЭЖ СО РАН) и Всероссийского института защиты растений (ВИЗР РАСХН), выделенных на территории Западной Сибири и Казахстана (таблица). Культуры выделены в равнинных или низкогорных (до 700 м н.у.м.) районах из насекомых разных систематических групп или из почвы в типичных для природных зон биоценозах. В зависимости от районов выделения изоляты были сгруппированы в 4 группы: 1) лесотундровые,

2) лесостепные, 3) северо-степные (из зоны раз-нотравно-дерновинно-злаковых степей), 4) южно-степные (из опустыненных степей предгорьев Тянь-Шаня). Штаммы поддерживали на искусственных питательных средах (ИПС) Чапека и Ваксмана [19] при 4°С и пересевали с периодичностью 1 раз в год.

Анализ радиального роста на ИПС. Исследование мицелиального роста культур проводили на агаризованной среде Ваксмана. Из 4-суточных культур, посеянных газоном, вырезали блоки диаметром 8 мм и помещали на среду в центр чашек Петри диаметром 90 мм. Культуры инкубировали в термостатах при 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35°С. В диапазоне температур 10—35°С за точку учета эксперимента были взяты 14 сут, когда при оптимальных температурах наиболее быстрорастущие колонии достигали краев чашек Петри. Измерение колоний проводили крест-накрест с точностью до 1 мм. При анализе данных для нивелирования индивидуальных различий в скорости роста изолятов вводили коэффициент: у.е. = = а/Ь х 100%, где у.е. — условные единицы роста (относительный рост), а — диаметр колонии изо-лята при определенной температуре, Ь — диаметр колонии изолята при оптимальной температуре (для большинства культур — 25°С). При анализе

радиального роста культур при 5°С за точку учета брали 60 сут и использовали только абсолютный показатель (диаметр колоний, мм). Все эксперименты ставили в 3 повторностях. Данные проанализированы с помощью многофакторного анализа (ANOVA, STATISTICA 6). Для оценки достоверности отличий использовали критерий Фишера.

Анализ генетических различий. Для анализа генетических отличий были использованы 7 ISSR праймеров, предложенных Эстрада и соавт. [20] для изучения биоразнообразия и филогенетических связей штаммов B. bassiana: 808 — (AG)8C; 809 - (AG)8G; 818 - (CA)8G; 842 - (GA)8YG; 885 -BHB(GA)7; 889 - DBD(AC)7; 891 - HVH(GT)7.

Культивитрование грибов для выделения ДНК проводили в жидкой среде Чапека с пептоном (0.4%) в течение 5 сут на ротационном шейкере при 110 об/мин и 26°С. Полученную биомассу отделяли от надосадочной жидкости центрифугированием. Выделение ДНК проводили из 100 мг осажденного мицелия при помощи набора DNeasy Plant Mini Kit фирмы "QIAGEN" согласно методике производителя.

ПЦР реакцию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 2.5 мкл 10х ПЦР буфера (100 мМ KCl, 200 мМ Трис-HCl pH 8.8, 0.1% Triton X-100), 2.5 мМ MgCl2, 10 мМ (NH4)2SO4, 0.2 мМ каждого из дНТФ, 5 пмол праймера, 50 нг ДНК-матрицы и 1.25 ед. Тод-полимеразы ("СибЭнзим").

Амплификация образцов была выполнена на амплификаторе БИС-110. Условия ПЦР реакции: денатурация - 94°С, 5 мин; отжиг - 94°С - 30 с, 52°С - 40 с, 72°С - 40 с, 35 циклов; элонгация -72°С - 15 мин. Анализ полученных ПЦР-фраг-ментов ДНК проводили при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле с бромистым этидием.

Для определения уровня генетического сходства изолятов составляли суммарную бинарную матрицу, в которой отмечалось присутствие или отсутствие полосы на электрофореграмме. Для построения дендрограммы был применен метод полной связи с использованием программы STATISTICA 6.

Оценка вирулентных свойств. При изучении уровня вирулентности изолятов при разных температурных режимах использовали гусениц 23 возрастов большой вощинной огневки Galleria mellonella L. и личинок 4 возраста колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say. Биотестирование проводили по стандартным методикам, описанным ранее [21, 22]. После заражения насекомых помещали на 10-15 сут в температурные условия оптимальные для течения микозов (21 или 25 °С) и неблагоприятные для их развития (30 или 33°С). Контроль температуры осуществляли каждые 60 мин с помощью автономных регистраторов температуры ("Рэлсиб"), помещенных в контейнеры с насекомыми. Погибших насекомых раскладывали на увлажн

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком