ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2013, том 63, № 3, с. 365-374
ФИЗИОЛОГИЯ ПОВЕДЕНИЯ; ^^^^^^^^^^^^ ОБУЧЕНИЕ И ПАМЯТЬ
УДК 612.821.6
ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ПРОФИЛЯ ГИППОКАМПА В ОТВЕТ НА ВВЕДЕНИЕ АНАЛОГА ТАФТЦИНА СЕЛАНКА
© 2013 г. Т. А. Коломин1, Т. Ю. Агапова1, Я. В. Агниуллин2, С. И. Шрам2, М. И. Шадрина1, П. А. Сломинский1, С. А. Лимборская1, Н. Ф. Мясоедов2
1 Отдел молекулярных основ генетики человека, 2 Отдел химии физиологически активных веществ, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва, e-mail: kotimur@img.ras.ru Поступила в редакцию 03.09.2012 г. Принята в печать 19.10.2012 г.
В настоящей работе проведена оценка влияния однократного и курсового введения синтетического аналога тафтцина — пептида селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) в дозе 200 мкг/кг на транскрипционный профиль клеток гиппокампа крысы с использованием технологии кДНК-микрочипов. Показано, что после однократного введения селанка более чем в 2 раза изменился уровень мРНК 36 генов, после курсового введения — 20 генов. При этом большинство из них кодируют белки, ассоциированные с плазматической мембраной (в том числе трансмембранные белки), что позволяет говорить о способности селанка регулировать ионный гомеостаз клеток гиппокампа и, тем самым, модулировать на молекулярно-генетическом уровне различные ион-зависимые процессы, к которым относятся процессы обучения и формирования памяти.
Ключевые слова: селанк, тафтцин, синтетическиерегуляторные пептиды, транскриптом.
Transcriptome Alteration in Hippocampus under the Treatment of Tuftsin Analog Selank
T. A. Kolomin, T. Yu. Agapova, Ya. V. Agniullin, S. I. Shram, M. I. Shadrina, P. A. Slominsky, S. A. Limborska, N. F. Myasoedov
Department of Molecular Basis of Human Genetics, Department of Chemistry of Physiologically Active Compounds, Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, e-mail: kotimur@img.ras.ru
The effect of single and course administration of Selank (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) in the dose 200 ^g/kg on the rat hippocampus transcriptional profile were studied using cDNA microarray technology. It was shown that mRNA levels of 36 genes changed more than 2-fold after a single intranasal Selank administration, and 20 genes — after course administration. It should be noted that most of them encode proteins associated with the plasma membrane (including transmembrane proteins). This suggests that Selank is able to regulate ion homeostasis of hippocampal cells and thereby modulate different ion-dependent processes, which include the processes of learning and memory formation.
Keywords: Selank, tuftsin, synthetic regulatory peptides, transcriptome. DOI: 10.7868/S0044467713030052
В настоящее время в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний ЦНС применяется множество лекарственных средств разной природы. Од-
нако, несмотря на огромное количество разработанных лекарственных препаратов, проблема лечения многих из ныне существующих заболеваний остается нерешенной. В
связи с этим одной из важнейших задач молекулярной биологии является разработка и изучение механизма действия новых лекарственных препаратов, которые окажутся более эффективными по сравнению с существующими продуктами фармации. На данный момент одним из ведущих направлений разработки лекарственных препаратов является использование соединений на основе природных регуляторных пептидов, которые, с одной стороны, оказывают направленное воздействие на организм, а с другой — практически не имеют побочных эффектов. Синтетические регуляторные пептиды обладают широким спектром клинических эффектов, однако до настоящего времени точный механизм их действия на организм остается неясным. В данном контексте большой интерес для изучения представляет изменение экспрессии генов, функционирующих в здоровом организме и реагирующих в ответ на различные физиологические воздействия.
К числу лекарственных препаратов на основе природных регуляторных пептидов относится разработанный в Институте молекулярной генетики РАН в сотрудничестве с НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН и недавно вошедший в клиническую практику в качестве анксиолитического и ноотороп-ного средства пептидный препарат селанк. Селанк является синтетическим аналогом тафтцина — короткого фрагмента Thr-Lys-Pro-Arg тяжелой цепи иммуноглобулина G человека, удлиненного с С-концевой части молекулы трипептидом Pro-Gly-Pro для повышения метаболической стабильности и продолжительности действия пептида [10]. В клинике было показано, что этот препарат эффективно купирует чувство тревоги и страха и в то же время обладает ноотропным действием, оказывая позитивное влияние на формирование памяти и процессы обучения [4]. Благодаря наличию таких свойств селанк приобрел широкое применение в лечении и профилактике стрессовых и тревожных состояний, генерализованных тревожных расстройств и неврастении, а также в качестве стимулирующего средства при повышенных психоэмоциональных нагрузках [4, 7]. В исследованиях in vitro и in vivo было показано, что селанк также обладает выраженными противовирусными свойствами в отношении вирусов гриппа А человека, вируса простого герпеса, цитомегаловируса и др. [1, 3, 7].
Ранее было установлено, что пептидные препараты способны изменять экспрессию генов. В отношении селанка подобные исследования практически не проводились. С целью установления возможного молекулярного механизма действия пептида на организм в настоящей работе был проведен анализ влияния однократного и курсового введения селанка на транскрипционный профиль клеток гиппокампа крысы с использованием технологии кДНК-микрочипов.
МЕТОДИКА
В эксперименте использовали самцов крыс линии Вистар со средней массой 260 г. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с "Руководством по уходу и использованию лабораторных животных" Национального института здоровья США (публикации NIH № 80-23), с учетом поправок, которые были внесены в 1996 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище и 12-часовым циклом освещения. Все крысы (n = 24) были разделены на три группы по 8 особей в каждой: контрольную (К), группы однократного (ОВ) и курсового (КВ) введения.
В течение 5 сут животным из групп К и ОВ один раз в сутки интраназально вводили де-ионизированную воду, животным из группы КВ — водный раствор селанка (200 мкг/кг) по 3 мкл в каждую ноздрю. На 6-е сутки животным из группы ОВ однократно интраназально вводили водный раствор селанка (200 мкг/кг) по 3 мкл раствора в каждую ноздрю. Спустя 1 ч животных всех групп декапитировали. Выделенную ткань гиппокампа помещали в пробирки, обработанные 0.1%-ным раствором диэтилпирокарбоната (DEPC), замораживали в жидком азоте и в дальнейшем хранили при —70°С.
Полученные от каждой крысы ткани гиппокампа объединяли в пределах каждой экспериментальной группы. Из каждого пула тканей выделяли тотальную РНК методом фенол-хлороформной экстракции с использованием набора Promega RNAgents® Total RNA Isolation System ("Promega", США) согласно рекомендациям производителя. Содержание РНК определяли методом флуоро-метрической детекции с использованием набора Quant-iT™ RNA Assay Kit на приборе Qubit® Fluorometer ("Invitrogene", США). На основе полученной РНК синтезировали ме-
ченную флуоресцентными красителями кДНК, которая была гибридизована на микрочипах SBC-R-RC-100-13 Rat 12K expression cDNA array (V1.3) ("Shanghai BioChip", Китай). Каждый микрочип содержал 11060 последовательностей, гомологичных известным последовательностям транскриптома крысы. Полученные после гибридизации значения сигнала флуоресценции подвергали попарному сравнению в системе эксперимент — контроль для каждого гена. Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ GenomeStudio GX Module v1.0 ("Illumina", США). После выравнивания и нормализации по положительным контролям (гены домашнего хозяйства) были отобраны гены со статистически значимым изменением уровня мРНК. Для дальнейшего более детального анализа были отобраны гены, уровень мРНК которых изменился в 2 раза и более. С целью установления структурно-функциональных связей отобранных генов был проведен биоинформатический анализ с использованием открытого Интернет-ресурса The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) V6.7 (ht-tp://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp). Данный ресурс позволяет объединить гены в соответствии со схожестью структурных и функциональных характеристик кодируемых ими белков [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исходя из данных, полученных при обработке результатов гибридизации на кДНК-микрочипе, было отобрано 36 генов, изменивших экспрессию более чем в 2 раза после однократного введения селанка (табл. 1) и 20 генов — после курсового введения пептида (табл. 2). Из табл. 1 можно видеть, что наибольшее снижение уровня мРНК (в 2.6 раза) после однократного введения селанка было отмечено для гена Slc1a2, кодирующего высокоспецифичный переносчик глутамата, который отвечает за удаление избытка глута-мата из межсинаптической щели. В 2.3 раза снижается уровень мРНК гена Map2k1, кодирующего киназу, которая принимает участие в передаче сигналов через активацию MAPK-сигнального пути, а также генаActnl, кодирующего актин-связывающий белок. Повышением относительного уровня мРНК в 3—4 раза характеризуются гены, кодирующие кини-ноген (Kngl), фосфолипазу (Pla2g16) и
переносчик пролина (Slc6a20). Наиболее значительное повышение уровня мРНК отмечено для двух генов — кинезина Kif2c (в 7.7 раза) и секреторного мембранного белка Scamp5 (в 9 раз).
Наибольшее снижение экспрессии при курсовом введении селанка было отмечено для гена Trpcl, уровень мРНК которого снизился в 3.4 раза (табл. 2). Почти в 3 раза снизился уровень мРНК гена Slc5a7, кодирующего высокоспецифичный переносчика хо-лина, который обеспечивает доставку холина в ацетилхолин-синтезирующие нейроны. В 3—3.5 раза повышается уровень мРНК генов Ptprn2, Gldn, Sipalll и Psmc2. Наи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.