ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 6, с. 413-424
= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1
ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСПОРТНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТОННЫХ НАСОСОВ КЛЕТОК КОЛЕОПТИЛЕЙ НА РАННИХ ЭТАПАХ РАЗВИТИЯ
ПРОРОСТКОВ КУКУРУЗЫ
© 2012 г. М. Ф. Шишова*, О. В. Танкелюн*, Е. Л. Рудашевская, В. В. Емельянов,
Н. В. Шахова, А. А. Кирпичникова
Санкт-Петербургский государственный университет, 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9 E-mail: mshishova@mail.ru Поступила в редакцию 22.06.11 г. Окончательный вариант получен 01.04.12 г.
Проведен сравнительный анализ транспортной активности протонных насосов (Н+-АТФазы плаз-малеммы, Н+-АТФазы вакуолярного типа и Н+-пирофосфатазы вакуолярного типа) в мембранных препаратах из клеток колеоптилей этиолированных проростков кукурузы (Zea mays L.). Показано, что начальные этапы развития колеоптиля при инициации роста растяжением характеризуются наиболее высокой активностью вакуолярной пирофосфатазы. В процессе дальнейшего роста все больший вклад в транспорт ионов водорода вносят АТФазные насосы как тонопласта, так и плазма-леммы с преобладающей активностью последней. При остановке роста активность протонных помп значительно снижается. Тем не менее, их субстратная специфичность и чувствительность к ингибиторам не изменяются, что может свидетельствовать о сохранении физиологического значения насосов в поддержании гомеостаза клетки.
Ключевые слова: Zea mays, колеоптиль, Н+-АТФазы Р-типа и V-типа, Н+-пирофосфатаза V-типа, транспорт протонов, везикулы.
ВВЕДЕНИЕ
Универсальным свойством живых клеток является активное поддержание внутриклеточного гомеостаза, в первую очередь постоянного уровня рН цитозоля. Тем не менее, как показывают многочисленные исследования, концентрация протонов в цитоплазме не является величиной строго постоянной. Изменение внутриклеточного рН может служить признаком перехода клеток к новой стадии онтогенеза, что свойственно как для животных, так и для растительных клеток (Busa, Niccitelli, 1984; Aerts et al., 1985; Галкина и др., 1991). Примером могут служить изменения рН цитозоля растительных клеток при поляризации яйцеклеток водорослей (Gibbon, Kropf, 1993), а также при завершении клеточного цикла, при переходе клетки к программируемой клеточной смерти (Drew et al., 2000). Кратковременные и пролонгированные (в ряде случаев осцилляцион-
* Авторы внесли равноценный вклад в данную работу. Сокращения: АО — акридиновый оранжевый, DCCD — ди-циклогексил карбодиимид, FCCP — карбонилцианид 4-(трифлуорометокси)фенилгидразон, FITC — флуоресце-ин изо-тио-цианат.
Адрес для корреспонденции: Мария Федоровна Шишова. 199034 Санкт-Петербург. Университетская наб. 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра физиологии и биохимии растений. Факс: 007 (812) 328-44-32; e-mail: mshishova@mail.ru.
ного характера) изменения рН возникают и в результате действия широкого спектра внешних и внутренних факторов. Резкие сдвиги рН цитозоля регистрируются при изменении состава и интенсивности освещенности (Felle, Bertl, 1986), снижении уровня кислорода (Felle, 2005), при недостатке воды (Wilkinson, 1999) и действии патогенов (Mathieu et al., 1996). Кроме того, способностью индуцировать изменения рН обладают фитогор-моны. Так, закисление цитозоля регистрируется при действии ауксина (Felle, 1988; Shishova, Lindberg, 1999), а защелачивание при обработке абсци-зовой кислотой (Gering et al., 1990; Blatt, Armstrong, 1993). Участие протонов в развитии широкого спектра физиологических реакций позволяет рассматривать их в качестве компонентов протонной сигнальной системы (Полевой, 1986; Felle, 2001; Тарчевский, 2002), использующей ионы водорода в качестве вторичных посредников.
Хорошо известно, что ионы Н+ выполняют в живой клетке важную регуляторную функцию. Изменение рН водных растворов приводит к изменению соотношения протонированных и не-протонированных кислотных и основных групп биологически активных молекул, а, следовательно, модифицирует такие их свойства, как, например, поверхностный заряд, сродство к лиганду и т.д. Даже кратковременные сдвиги концентрации ионов Н+ в цитозоле могут привести к изме-
нению активности целого ряда ферментов (в связи с различиями в рН-оптимумах, изменения сродства к субстрату, связывания с регуляторны-ми белками, в первую очередь на уровне белок-белковых взаимодействий, и т.д.). Кроме того, протон-зависимые сигнальные каскады могут быть тесно сопряжены с другой важнейшей сигнальной системой — кальциевой, так как связывание Са2+ с регуляторными белками (такими как, кальмодулин) зависит от концентрации свободных протонов.
Возвращение системы к первоначальному состоянию может осуществляться с помощью различных механизмов, включающих ряд метаболических реакций, потребляющих или продуцирующих протоны, а также процессов трансмембранного транспорта ионов Н+ между цитоплазмой, внутриклеточными компартментами и апопла-стом. Активную транслокацию протонов в растительных клетках обеспечивают такие Н+-насосы, как Н+-АТФазы плазмалеммы и тонопласта, а также Н+-пирофосфатаза вакуолярного типа.
Н+-АТФаза плазмалеммы, характерная для клеток растений и грибов, относится к АТФазам Р-типа, т.е. фосфорилируется при катализе реакции расщепления АТФ, (ЕС 3.6.3.6.), является Mg^-зависимой и К+-стимулируемой, играет важную биоэнергетическую и регуляторную роль в физиологии клеток (Полевой, 1986; Gaxiola et al., 2007). За счет энергии гидролиза АТФ фермент переносит протоны из цитоплазмы через плазматическую мембрану клетки, создавая электрохимический градиент протонов, который необходим для поддержания живого состояния клетки в целом, так как обеспечивает движущую силу для вторичного транспорта веществ через плазмалемму. Н+-АТФаза участвует в развитии ответных реакций клеток на различные воздействия внешней и внутренней среды, такие как свет, грибные токсины, регуляторы роста (Serrano, 1989; Palmgren, 1991). Одним из важных физиологических процессов, в которых принимает участие Н+-АТФаза плазмалеммы, является активируемый ауксином специфичный для растительных клеток рост растяжением (Rayle, 1973; Полевой, 1986; Hager, 2003). Активность Н+-АТФазы одновременно создает условия для двух процессов необходимых для роста клеток: поступления осмотических веществ в клетку и, следовательно, увеличения ее объема, а также увеличения растяжимости клеточной стенки (Serrano, 1993).
Н+-АТРаза вакуолярного типа (V-типа; EC 3.6.1.3) — широко распространенный у эука-риотических клеток протонный насос внутриклеточных мембран. Она организована как мульти-субъединичный комплекс, образованный над-мембранным каталитическим и трансмембранным Н+-проводящим доменами общей молеку-
лярной массой около 750 кДа (Merzendorfer et al., 1997; Ratajczak, 2000). По строению V-АТФаза эволюционно родственна АТФ-синтазам F-типа (Gruber et al., 2001; Kluge et al., 2003), но присутствует в мембранах, ограничивающих различные внутриклеточные компартменты с более кислым, чем цитоплазма содержимым. В клетках растений основным местом локализации V-АТРаз является вакуолярная мембрана. Кислые значения рН со-дер-жимого литических вакуолей и секреторных везикул, поддерживаемые Н+-АТФазами, требуются для активности гидролитических ферментов. Экспериментально установлено участие V-АТФаз в процессах эндо- и экзоцитоза (Dettmer et al., 2006; Schumacher, 2006). Исследования последних лет показали, что V-АТФаза играет важную роль в регуляции эмбрионального развития и роста растяжением (Strompen et al., 2005).
Н+-пирофосфатаза вакуолярного типа (EC 3.6.1.1.) обнаружена в клетках высших растений, некоторых зеленых водорослей и одноклеточных паразитических организмов, родственной ей формой считают обратимую пирофосфат-син-тазу несерных пурпурных бактерий (Rea, Poole, 1993; Maeshima, 2000). кДНК V-пирофосфатазы, клонированные из ряда растений, бактерий и некоторых протист обладали очень высокой степенью гомологии (86—91%) (Lin et al., 2005; Van et al., 2005). Она представляет собой гомодимер-ный белок, с молекулярной массой субъединицы 75—81кДа и 14 трансмембранными доменами. Н+-пирофосфатаза V-типа локализована в вакуо-лярной мембране, в мембранах аппарата Гольджи, у некоторых объектов — в плазматической мембране (Baltscheffsky et al., 1999). Установлено, что помимо регуляции рН вакуоли, она играет важную роль в регуляции интенсивности везикулярного транспорта, и тем самым оказывает влияние на количество ряда физиологически значимых белков, таких как Н+-АТФаза и переносчики ауксина PIN1 на плазмалемме (Li et al., 2005).
Таким образом, все рассмотренные протонные насосы играют огромную роль в обеспечении жизнедеятельности растительной клетки, а также в ее способности воспринять сигнал и сформировать адаптивный физиологический ответ. Не вызывает сомнения, что они служат наиважнейшим звеном такого процесса, как рост растяжением, заключающегося в многократном увеличении размеров клетки и ее вакуолизации. Тем не менее, остается дискуссионным вопрос о вкладе каждого из трех протонных насосов в этот процесс и о возможном перераспределении их ролей в ходе развития. Проведенное ранее исследование свойств Н+-АТФазы плазмалеммы выявило изменение гидролитической активности фермента в ходе онтогенеза клетки (Рудашевская и др., 2005, 2009). В связи с этим цель настоящего исследования заключалась в сравнительном анализе протон-
транспортирующей активности Н+-АТФазы плазмалеммы, а также протонных насосов тоно-пласта в процессе роста растяжением.
В качестве модельного объекта в исследовании роста клеток растяжением часто используют ко-леоптили злаков, которые представляют собой быстро развивающиеся органы ювенильного проростка: за несколько суток они проходят период быстрого роста и переход к завершению своей физиологической функции. У кукурузы при выращивании проростков при 26—27°С в темноте все клетки колеоптиля переходят от деления к росту растяжением на третьи сутки развития проростка (Москалева, Полевой, 1987). К пятым суткам, когда настоящий лист выходит наружу из-под защиты колеоптиля, происходит значительное
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.