ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 3, с. 359-366
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИЗОФОРМ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ У РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ДИКОГО ТИПА И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ГЕНОМ А12-АЦИЛ-ЛИПИДНОЙ ДЕСАТУРАЗЫ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ АДАПТАЦИИ
© 2014 г. Н. В. Нарайкина, М. С. Синькевич, И. Н. Дёмин, А. А. Селиванов,
И. Е. Мошков, Т. И. Трунова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 22.02.2013 г.
Изучали изменения общей активности супероксиддисмутазы (СОД) и роль ее изоформ в закаливании растений картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Десница) дикого типа и трансформированных геном desA Д12-ацил-липидной десатуразы из Synechocystis sp. PCC 6803. Растения, выращенные в гидропонической культуре, в возрасте восьми недель подвергали действию закаливающей температуры (5°С, 6 суток). До закаливания общая активность СОД у трансформанта была несколько выше, чем у контрольных растений. К первым суткам закаливания у обоих генотипов картофеля происходило повышение ее активности почти в полтора раза, но по абсолютным значениям у трансформанта эта величина была существенно выше. В дальнейшем происходило снижение общей активности СОД у обоих генотипов с возвратом почти до исходного уровня к концу шестых суток. С помощью электрофоретического и ингибиторного анализов у растений картофеля выявлены три типа СОД, причем обнаружили одну изоформу Mn-СОД, четыре изоформы Fe-СОД и две Cu/Zn-СОД. Наибольшая активность как до, так и в процессе закаливания растений обоих генотипов отмечена для Fe-СОДЗ. Такие изменения активности СОД соответствовали скорости генерации супероксид анион-радикала и повышению содержания продуктов ПОЛ. На основании полученных данных сделано заключение, что в процессе закаливания холодостойких растений картофеля общая активность СОД в основном изменялась за счет активности Fe-СОДЗ и в некоторой степени в результате повышения активности Си^п-СОД2, что было особенно заметно в начале закаливания и было более выражено у трансформанта. Предположили, что это связано с более высокой у трансформанта, по сравнению с контролем, скоростью генерации супероксид-аниона в этот период.
Ключевые слова: Solanum tuberosum — трансформация - устойчивость к низким температурам — закаливание — окислительный стресс — АФК — супероксиддисмутаза — супероксид-анион
DOI: 10.7868/S0015330314030099
ВВЕДЕНИЕ
Согласно современным представлениям, окислительный стресс считается одним из основных факторов повреждения теплолюбивых растений, подвергающихся воздействию низкой температуры [1]. Некоторые авторы полагают, что общие симптомы повреждения клеток и особенно клеточных мембран (повышение вязкости, формирование областей гелевой фазы, деградация фос-
Сокращения: КД — конъюгированные диены; ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты; СОД — супероксиддисмутаза.
Адрес для корреспонденции: Синькевич Максим Сергеевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (499) 977-8018; электронная почта: sinkevich_m@mail.ru
фолипидов и накопление свободных ЖК) являются следствием развития окислительного стресса и что устойчивость к нему определяет устойчивость ко многим стрессовым факторам, в том числе и к низкой температуре [2]. В отличие от теплолюбивых растений, у которых уже при положительных околонулевых температурах развивается четко выраженный окислительный стресс [3], холодостойкие растения выживают даже после длительного пребывания при таких температурах [4]. Это позволяет предположить более высокую, по сравнению с теплолюбивыми, устойчивость холодостойких растений к окислительному стрессу, вызванному низкими температурами. Однако причины, препятствующие развитию свободно-
радикальных процессов у растений этой группы, изучены недостаточно.
Известно, что одним из важных симптомов повреждения растений от окислительного стресса является накопление в клетках растений малонового диальдегида (МДА) как конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ). Интенсивность процессов ПОЛ определяется, с одной стороны, скоростью генерации АФК, а с другой, — эффективностью работы антиокси-дантной системы, в том числе антиоксидантных ферментов, среди которых ведущая роль отводится супероксиддисмутазе (СОД) [5]. В настоящее время имеются данные о том, что в ответ на действие низкой температуры у различающихся по устойчивости растений наблюдаются и неодинаковые изменения в активности разных типов СОД [6].
Помимо возникновения окислительного стресса, при воздействии пониженных температур на растения наблюдается фазовый переход липидов мембран клеток из жидкокристаллического состояния в гелеобразное [7]. Температура фазового перехода зависит от многих факторов, среди которых существенная роль отводится содержанию в мембране полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), имеющих одну или несколько двойных связей, в образовании которых участвуют ферменты десатуразы. Их роль в формировании устойчивости к пониженной температуре была показана в ряде работ [8, 9], в том числе в опытах с растениями, трансформированными геном Д9-ацил-липидной десатуразы из Synecho-vulcanus [10]. Известно, что одной из причин образования АФК является "утечка" электронов из электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) сопрягающих мембран клетки при воздействии низкой температуры. Поскольку функциональная активность мембран в значительной степени зависит от их жидкостных свойств, определяемых содержанием ПНЖК, можно предположить наличие взаимосвязи между генерацией АФК и уровнем ПНЖК липидов, входящих в состав клеточных мембран, как известно, существенно меняющимся в процессе закаливания растений [11].
В связи с этим в задачу настоящей работы входило исследование взаимосвязи образования
АФК (преимущественно генерации 02 ) с общей активностью СОД, отдельных ее типов (Ре-, Мп-, Си^п-СОД) и их изоформ в процессе длительного действия закаливающей температуры на растения картофеля дикого типа, а также на растения, трансформированные геном desA Д12-ацил-ли-пидной десатуразы из Synechocystis 8р. РСС 6803 [11], отличающиеся повышенным содержанием ПНЖК в составе мембранных липидов и более высокой устойчивостью к окислительному стрессу при гипотермии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы нетрансформи-рованные растения картофеля дикого типа (Solanum tuberosum L., сорт Десница, далее "контрольные растения") как типичного представителя холодостойких растений и растения, трансформированные вектором, несущим ген desA ацил-липидной десатуразы из Synechocystis sp. PCC 6803, трансляционно слитый с геном лихе-назы licBM3 под общим промотором 35S СаМУ. Трансформанты были получены в совместной работе сотрудников ИФР РАН и ИОГен РАН [11].
Растения размножали черенкованием и выращивали в течение восьми недель в камере фитотрона ИФР РАН на нейтральном минеральном субстрате (перлите) с дополнительной регулярной подкормкой удобрением Кемира Люкс, при температуре 22°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 100 мкмоль квантов/(м2 с).
Восьминедельные растения подвергали действию низкой закаливающей температуры 5°С в течение 6 суток при освещенности 50 мкмоль квантов/(м2 с) в климатической камере KBW-240 ("Binder GmbH", Германия). Подбор сочетания температуры, продолжительности ее воздействия и светового режима, а также подтверждение закаливающего эффекта были проведены нами ранее [4].
Скорость образования АФК, преимущественно супероксидного анион-радикала O2-, определяли, как описано ранее [12], с некоторыми модификациями [4].
Содержание малонового диальдегида и конъ-югированных диенов определяли, соответственно, методами [13] и [14], подробно описанными ранее [15].
Для выделения белка навеску листьев массой 500 мг гомогенизировали в жидком азоте, помещали в пробирку и добавляли два объема среды выделения, содержащей 50 мМ Трис-НС1, рН 7.6, 3 мМ ЭДТА, 250 мМ сахарозу, 3.6 мМ цистеин, 5 мМ аскорбиновую кислоту, 3 мМ MgC12, 2 мМ ДТТ, 2 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфто-рид). Все операции по выделению белка проводили при 4°С. Образцы центрифугировали в течение 20 мин при 16000 g и 4°С. Супернатант очищали на колонках PD-10 midiTrap G-25 ("GE Healthcare", США). Колонки предварительно промывали 15 мл охлажденного 50 мМ Трис-НС1, рН 7.6, затем загружали 1 мл супернатанта, промывали 1.5 мл того же буфера и собирали 1.5 мл элюата. Полученный элюат использовали для определения общей активности СОД и ее изофер-ментов в геле нативного электрофореза.
Общую активность СОД определяли по методу [16] с некоторыми модификациями [4].
Содержание белка в пробах оценивали на основании реакции с бицинхониновой кислотой с ис-
(а)
¡2
0 1 2 3 4 5 6 Продолжительность закаливания, сутки
" (б)
ьи
-i---В 2
0123456 Продолжительность закаливания, сутки
(в)
1 $ 2
л
с
ч 8 о s
и «
о р
3
с
140 120 100 80 60 40 20
0
1 5 2
0123456 Продолжительность закаливания, сутки
0123456 Продолжительность закаливания, сутки
Рис. 1. Изменение скорости генерации О2 (а), содержания промежуточных (конъюгированные диены — КД ЖК) (б) и конечных (МДА) (в) продуктов ПОЛ у контрольных (1) и ёвзЛ-НеВМЗ (2) растений во время закаливания (5°С, 6 суток).
пользованием BCA kit ("Sigma"), согласно инструкции производителя, и БСА в качестве стандарта.
Для определения изоферментного состава СОД
проводили электрофорез по методу Davis [17] в 15% полиакриламидном геле на приборе Mini
Рис. 2. Изменение общей активности СОД у контрольных (1) и ёвзЛ-НеВМЗ (2) растений во время закаливания (5°С, 6 суток).
PROTEAN Tetra ("Bio-Rad", США); толщина геля - 0.75 мм. В лунки вносили по 15 мкг белка с добавлением сахарозы для "утяжеления" образца и 2 мкл 0.5% бромфенолового синего. Электрофорез проводили при 4°С в течение 3 ч 15 мин при напряжении 180 В (условия подбирали в предварительных опытах). Для проверки эффективности выравнивания белковых проб один из гелей (см. ниже) окрашивали в течение 1 ч 0.1% Кумасси G-250, предварительно зафиксировав его в течение 30 мин в растворе, в состав которо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.