УДК 577.352.5
ИЗМЕНЕНИЯ АНТЕННЫ ФОТОСИСТЕМЫ I, ИНДУЦИРУЕМЫЕ КРАТКОВРЕМЕННЫМ ПРОГРЕВОМ
© 2013 г. С. М. Кочубей*, В. В. Шевченко, Т. А. Казанцев
Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, 03022 Киев, Васильковская 31/17;
* электронная почта: smk_off@mail.ru Поступила в редакцию 01.03.2012 г.
Исследовали изменения спектров низкотемпературной флуоресценции хлоропластов гороха и спектров возбуждения длинноволновой флуоресценции, вызываемые кратковременным прогревом при температуре 45°С в темноте или при подсветке белым светом интенсивностью 260 или 1400 мкмоль • м-2 • с-1. Все варианты прогрева снижают интенсивность длинноволновой полосы флуоресценции. Интеграл спектра возбуждения уменьшается при прогреве в темноте и увеличивается при прогреве с подсветкой. Выявлены вызываемые различными вариантами прогрева изменения четырех наиболее интенсивных компонентов тонкой структуры длинноволновой полосы флуоресценции — 726, 729, 731 и 735 нм. Они оказались сходными у первых трех компонентов и отличались у компонента 735 нм. В тонкой структуре спектра возбуждения выявлено 25 компонентов. Положения максимумов большинства из них соответствуют пикам поглощения белков ЬЬса. Компоненты флуоресценции 726, 729 и 731 нм отнесены к свечению внешней антенны фотосистемы I на основании обнаруженной корреляции изменений при разных вариантах прогрева их интенсивности и интенсивности в спектре возбуждения в области поглощения хлорофилла Ь и коротковолновых форм хлорофилла а. Интенсивность компонента флуоресценции 735 нм изменяется параллельно только с изменениями интенсивности в спектре возбуждения в длинноволновой области, которая соответствует поглощению длинноволновых форм хлорофилла а. Это позволяет отнести компонент 735 нм к свечению внутренней антенны. Анализ изменений в спектрах флуоресценции и возбуждения флуоресценции, вызываемых прогревом, позволил выявить изменения в переносе энергии в антенных комплексах фотосистемы I. После прогрева в темноте происходит ухудшение переноса энергии во внешней и во внутренней антеннах. В обоих вариантах прогрева на свету усиливается перенос энергии во внешней антенне. Во внутренней антенне сохраняется эффективность переноса энергии, близкая к уровню в контроле. Высказано предположение, что подсветка при высокотемпературном прогреве вызывает такое состояние антенного комплекса фотосистемы I, которое может обеспечить увеличение поступления энергии на реакционные центры.
Ключевые слова: низкотемпературные спектры флуоресценции хлоропластов, фотосистема I, кратковременный прогрев.
БОТ: 10.7868/80233475512050088
Механизмы, регулирующие активность фотосинтетического аппарата, являются одной из актуальных проблем в современных исследованиях фотосинтеза. Возможность адаптации организма к изменяющимся условиям внешней среды обусловлена динамическими свойствами фотосинтетического аппарата, которые обеспечивают перестройку его структуры и функций. Эти изменения происходят в широком временном диапазоне, начиная с момента воздействия фактора и до установления новой структурно-функциональной конфигурации, соответствующей состоянию адаптации [1].
Сокращения: ФИ — фотосистема I, ФСП — фотосистема II, ДВ — длинноволновая.
Одним из подходов к изучению начальных стадий адаптационного процесса является использование кратковременного теплового или светового воздействия. Выяснение характера структурных перестроек и связанных с ними функциональных изменений позволит в дальнейшем понять пути развития адаптационного процесса. В настоящее время имеется ряд данных, показывающих, что изменение освещенности влияет на состояние светособирающих антенн ФСП и ФО. В результате возникают изменения в электрон-транспортной цепи, происходит повышение активности генетического аппарата, что позволяет обеспечить акклиматизацию организма [2—4]. Влияние кратко-
временного теплового воздействия оценивали в основном по изменению функциональных показателей [5—8]. Данных о воздействии теплового фактора или комбинации тепло + свет на структуру комплексов ФС11 и ФС1 сравнительно немного. Выявлено разобщение светособирающего комплекса ЬИС11 с комплексом ФС11 при длительном прогреве при температуре выше 35°С в темноте [9]. В мембранах интактных тилакоидов прогрев при температуре выше 40°С приводит к постепенному разупорядочению макродоменов ЬИСН [10]. Нами было показано, что кратковременный прогрев изменяет состояние антенного комплекса ФС11, причем по-разному в темноте или при подсветке [11]. Имеются данные об отделении внешних белков кислородвыделяющего комплекса и выхода эндогенного Мп после кратковременного высокотемпературного прогрева тила-коидных мембран [12, 13]. Данные об изменениях в комплексе ФС1 практически отсутствуют.
В представленной работе изучены изменения состояния антенны ФС1, вызываемые кратковременным прогревом при 45°С в темноте или при подсветке светом различной интенсивности. Проанализированы изменения тонкой структуры длинноволновой (ДВ) полосы в низкотемпературном спектре флуоресценции хлоропластов. Предполагается [14], что ДВ полоса принадлежит излучению светособирающей антенны ФС1. Рассмотрены также спектры возбуждения ДВ флуоресценции, которые позволяют получить сведения о вкладе поглощения различных форм хлорофилла, передающих энергию на центры с ДВ флуоресценцией.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растения гороха выращивали на вегетационной площадке в течение 2 недель в апреле и мае. Температуру воздуха и освещенность на уровне растений измеряли ежедневно с момента появления проростков до отбора растений для экспериментов. Средние значения температуры и освещенности были равны 18°C и 23000 лк соответственно. Хлоропласты с частично нарушенной внешней оболочкой выделяли как описано ранее [15], затем ресуспендировали в среде, содержащей 10 мМ трициновый буфер (pH 7.5), 0.4 М сахарозу, 10 мМ NaCl и 5 мМ MgCl2.
Температурная обработка. Контрольный образец сохраняли в темноте при 5°C. Прогрев при 45°С осуществляли следующим образом. Суспензию хлоропластов помещали в плоскодонную колбу так, чтобы образовался тонкий слой. Затем колбу опускали в воду с температурой 45°C и выдерживали в течение 5 мин в темноте или при подсветке. В последнем случае дно колбы освещали белым светом, который проходил через слой воды толщиной 5 см. Интенсивность света
была равна 260 или 1400 мкмоль • м-2 • с-1. Содержание хлорофилла в суспензии хлоропластов было равно 0.03 мг/мл.
Низкотемпературные спектральные измерения.
Для низкотемпературной спектроскопии использовали тонкие воздушно-сухие пленки суспензии хлоропластов на стеклянных подложках, приготовленные как описано ранее [16, 17]. Пленки помещали в оптический криостат [18] в пары жидкого азота и записывали спектры флуоресценции согласно [19] на модифицированной установке, собранной в лаборатории. Пленки имели высокую прозрачность, их низкотемпературные спектры флуоресценции были идентичными спектрам, записанным на образцах суспензии, замороженной в буферно-глицериновой смеси [16, 17]. Поглощение образца в максимуме красной полосы не превышало 15%.
Флуоресценцию возбуждали светом от свето-диода с излучением при 450 нм и записывали в интервале 650-800 нм в цифровом виде с шагом 0.5 нм. Полуширина пропускания монохромато-ра была равна 1 нм. Интенсивность актиничного света, который проходил через образец, записывали в течение времени регистрации спектра флуоресценции с помощью дополнительного оптического канала. Эти данные использовали для нормирования спектров флуоресценции по поглощению контрольного образца с тем, чтобы устранить небольшие отличия в поглощении различных образцов.
Спектры возбуждения измеряли на тех же образцах, на которых измеряли спектры флуоресценции, как описано ранее [17]. С помощью возбуждающего монохроматора на образец посылали монохроматический свет в диапазоне 630-720 нм. Полуширина щели монохроматора была равна 2нм, шаг сканирования 0.5 нм. Интенсивность ДВ флуоресценции при 735 нм фиксировали в спектральном интервале полушириной 4 нм, который выделяли с помощью измеряющего моно-хроматора. Наша оценка показала, что спектральный интервал, выделяемый измеряющим моно-хроматором, включает 7, 18, 34 и 41% вклады компонентов 726, 729, 731 и 735 нм тонкой структуры ДВ полосы флуоресценции. Для проведения такой оценки эти компоненты были смоделированы контурами Гауссовской формы с равной интенсивностью и полушириной 10 нм. Эти параметры близки к полученным нами ранее при разложении на элементарные контуры ДВ полосы флуоресценции субхлоропластных фрагментов интергранальных тилакоидов [20]. Вторые производные вычисляли с использованием программного пакета Origin 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 показаны спектры низкотемпературной флуоресценции хлоропластов, прогретых при 45°С в темноте и при подсветке светом двух интенсивностей. Как следует из рис. 1 и табл. 1, разные варианты прогрева по-разному влияют на интенсивность, полуширину и положение максимума ДВ полосы.
Рассмотрение тонкой структуры ДВ полосы позволяет выяснить причины изменения ее параметров, вызываемых прогревом. На рис. 2 приведены графики второй производной, которые, как показано многочисленными исследованиями [20—22], позволяют наилучшим образом выявить тонкую структуру ДВ полосы. Из рис. 2 следует, что различные варианты прогрева вызывают изменения интенсивности компонентов структуры и разнонаправленные сдвиги некоторых из них, что обусловливает сдвиг максимума ДВ полосы и изменение ее полуширины. Так, например, при прогреве на сильном свету увеличивается интенсивность компонентов с коротковолновой и длинноволновой стороны от компонента 2 (табл. 1), что, приводит к уширению интегральной полосы.
Рассмотрение нормированных к контролю изменений интенсивности компонентов 1—4 (табл. 1) при различных вариантах прогрева позволяет обнаружить сходство компонентов 726, 729 и 731 нм и отличие компонента 735 нм (рис. 3). Это обусловливает высокую степень корреляции изменений первых трех компонентов и практическое отсутствие корреляции с компонентом 735 нм (табл. 2).
Характер изменений формы и параметров с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.