ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 1, с. 80-85
УДК 581.1
ИЗМЕНЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ СВЕТОРАССЕЯНИЯ СИМБИОСОМ ИЗ КОРНЕВЫХ КЛУБЕНЬКОВ Vicia faba КАК ИНДИКАТОР ТРАНСПОРТА ИОНОВ И МЕТАБОЛИТОВ ЧЕРЕЗ ПЕРИБАКТЕРОИДНУЮ МЕМБРАНУ
© 2004 г. И. М. Андреев, В. В. Крылова, П. Н. Дуброво, С. Ф. Измайлов
Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 04.04.2002 г.
Исследовали пассивный транспорт ионов и метаболитов через перибактероидную мембрану (ПБМ) симбиосом, выделенных из корневых клубеньков кормовых бобов (Vicia faba L.), следя за изменениями оптической плотности суспензии этих структур в бескалиевой среде при 546 нм, реально отражающими изменения интенсивности их светорассеяния. Деполяризация ПБМ с помощью катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) вызывала увеличение интенсивности светорассеяния суспензии симбиосом. Этот эффект усиливался после добавления к инкубационной среде К+-ионофора валиноми-цина. Аналогичный эффект наблюдали и при добавлении к суспензии симбиосом К+/И+-антипорте-ра нигерицина. В экспериментах того же типа на препаратах бактероидов, полученных из выделенных симбиосом, не выявлено сколько-нибудь заметных изменений интенсивности светорассеяния их суспензий в присутствии тех же мембранно-активных соединений. Уменьшение интенсивности светорассеяния суспензии симбиосом отмечено в ответ на добавление к ней малата или сукцината. Последующее добавление к инкубационной среде сантимолярных концентраций ионов калия заметно ускоряло этот процесс. Добавление к суспензии симбиосом глутамата - соединения, которое, как правило, не проникает через ПБМ корневых клубеньков бобовых, не изменяло интенсивности светорассеяния. Эти результаты свидетельствуют, что наблюдаемое изменение интенсивности светорассеяния суспензии симбиосом отражает осмотически-индуцированные изменения их объема. Предполагается, что такое изменение объема симбиосом в основном вызвано изменением размера их перибактероидного пространства (ПБП). Инкубация симбиосом в бескалиевой среде сопровождалась закислением их ПБП, которое ускорялось валиномицином, карбонилцианид-и-трифторме-токсифенилгидразоном (FCCP) и нигерицином и снималось в присутствии относительно высоких концентраций калия в инкубационной среде. Полученные данные указывают на относительно высокую проницаемость ПБМ симбиосом для ионов К+.
Vicia faba - симбиосомы - перибактероидная мембрана - светорассеяние - ионы К+ - малат - сук-цинат - глутамат
В корневых клубеньках бобовых растений процесс фиксации атмосферного азота происходит в симбиосомах. В этих особых структурах бактероиды, специфически дифференцированные клетки почвенных бактерий - ризобий, отделены от цитозоля растительной клетки перибак-тероидным пространством (ПБП) и перибактеро-идной мембраной (ПБМ) [1, 2].
Сокращения: ПБМ - перибактероидная мембрана, ПБП -перибактероидное пространство, ТФФ+ - катион тетрафенилфосфония, БССР - карбонилцианид-и-трифторметокси-фенилгидразон, ВТР - бис-трис-щюпан. Адрес для корреспонденции: Андреев Игорь Михайлович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 07 (095) 977-80-18; электронная почта: pmembrane@ippras.ru
Симбиосомы занимают, как правило, большую часть объема инфицированных клеток клубенька [2]. Согласно имеющимся данным [3-6], симбиосомы в таких клетках способны выполнять некоторые функции, свойственные вакуолям обычных растительных клеток. Так, установлено, что среда внутри ПБП симбиосом характеризуется низким значением рН и содержит ряд протеолитических ферментов, обычно присутствующих внутри вакуолей. Таким образом, ПБП представляет собой литический компартмент инфицированных клеток клубенька [3]. Кроме того, показано, что симбиосомы ведут себя как Са-депо и способны к активной аккумуляции ионов Са2+, поглощаемых из цитозоля растительной клетки в ходе работы Са2+-транслоцирующей АТФазы на ПБМ [4, 5]. В свете этих данных весьма вероятно, что подобно вакуолям симбиосомы участвуют и в
осморегуляции инфицированных клеток клубенька. Результаты недавних исследований функциональной активности нодулина 26 в ПБМ сим-биосом говорят в пользу такой возможности. Они указывают на действие этого интегрального мембранного белка как аквапорина [6]. В этой связи большой интерес представляют характеристики поведения симбиосом как осмотически-активных компартментов в клетках корневых клубеньков бобовых. Однако прямых данных, демонстрирующих осмотически-индуцированные изменения объема симбиосом в результате вариации в них уровня тех или иных осмолитов, известно мало [7]. Так, показано, что накопление пролина в сим-биосомах корневых клубеньков бобовых в условиях солевого стресса сопровождается увеличением размера их ПБП [8]. Отмечено также, что объем ПБП заметно снижается при помещении изолированных симбиосом в гипертоническую среду [9]. Вместе с тем, детали поведения других осмолитов, поглощаемых симбиосомами, остаются неизвестными. Также не ясно, какой конкретно компартмент симбиосом, бактероидный или пери-бактероидный, вносит основной вклад в осмотические изменения их объема.
Хорошо известно, что клетки большинства эу-и прокариот обогащены ионами К+ как их основными осмотически-активными компонентами [10]. Вероятнее всего, это справедливо и для инфицированных клеток клубеньков бобовых [11-13]. Однако информация о размере и распределении пула ионов К+ внутри симбиосом и механизме их транспорта через ПБМ практически отсутствует. Имеющиеся данные демонстрируют лишь перенос этого катиона через ионный канал в ПБМ, предназначенный для выхода аммония из симбиосом в цитозоль растительной клетки [14]. Кроме того, не известны и факторы, контролирующие транспорт К+ через ПБМ.
Для изучения транспорта веществ через мембраны изолированных клеточных органелл часто используется метод измерения светорассеяния их суспензий, позволяющий следить за осмотическими изменениями их объема [15]. В принципе, не исключена возможность его применения с той же целью в случае изолированных симбиосом корневых клубеньков бобовых. То обстоятельство, что размер симбиосом сравним с размером некоторых внутриклеточных органелл, которые были исследованы с использованием того же метода [15, 16], может служить основанием для его применения в исследованиях транспорта веществ через ПБМ. В настоящей работе на основе измерения интенсивности светорассеяния суспензии симбиосом из корневых клубеньков кормовых бобов, а также сдвига рН внутри этих клеточных структур изучен экспорт из них ионов К+ и поглощение ими малата и сукцината.
МЕТОДИКА
Растения кормовых бобов (Vicia faba L., сорт Русские черные) выращивали, как описано ранее [12]. Симбиосомы из корневых клубеньков этих растений были выделены описанным ранее методом, включающим очистку их в градиенте плотности перколла [12]. Бактероиды выделяли путем осмотического лизиса симбиосом [12]. После выделения симбиосомы и бактероиды хранили при 4°С в среде, содержащей 0.4 M сорбита и 20 мМ Нерез-бис-трис-пропана (BTP), pH 7.0.
За осмотическими изменениями объема симбиосом в результате вариации в них уровня ионов К+ или метаболитов следили по изменению оптической плотности суспензии этих структур при 546 нм. При выбранной длине волны измерения не наблюдали сколько-нибудь специфического поглощения света симбиосомами. Поэтому все отмеченные изменения оптической плотности суспензии симбиосом реально отражали изменения интенсивности ее светорассеяния. Спектрофото-метрические измерения проводили при комнатной температуре на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония), действующем в двухлучевом режиме. Для измерений использовали стандартные 1-сантиметровые кюветы, содержимое которых в ходе экспериментов не перемешивалось. Симбиосомы или бактероиды (200 и 250 мкг общего белка соответственно) добавляли к инкубационной среде, содержащей 0.4 M сорбита и 20 мМ Нерез-BTP, pH 7.0 и находящейся в обеих кюветах спектрофотометра. Измерения начинали после предварительной компенсации разности оптических поглощений суспензий симбиосом или бактероидов в опытной и контрольной кюветах в режиме коррекции базовой линии.
За кинетикой снижения рН внутри ПБП симбиосом следили по изменению разности поглощений при 492 и 540 нм (Л492-Л540) проникающего через мембраны ДрН-индикатора акридинового оранжевого [17], добавленного в концентрации 12 мкМ к инкубационной среде (2 мл) указанного выше состава. Измерения проводили на том же спектрофотометре в двухволновом режиме работы прибора и в тех же отмеченных выше условиях.
Содержание белка в препаратах определяли по методу Bradford [18] после их предварительной обработки 0.05%-ным Тритоном Х-100 с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина.
В работе использовали Hepes, малат, сукцинат, глутамат (натриевые соли) и акридиновый оранжевый фирмы "Serva" (Германия); ВТР (бис-трис-пропан, 1,3-бис-трис-(гидроксиметил)метилами-нопропан) и валиномицин - "Sigma" (США); FCCP (карбонилцианид-я-трифторметоксифенилгидра-зон), и тетрафенилфосфоний хлорид - "Fluka" (Швейцария); нигерицин - "Calbiochem" (США).
симбиосомы
I
(+K2SO4)
симбиосомы
к валиномицин
I
АА492-540 = 0.0063 2 мин
(NH4)2SO4
(NH4)2SO4
Рис. 1. Кинетика снижения pH внутри симбиосом, суспендированных в бескалиевой инкубационной среде, содержащей АрН-индикатор акридиновый оранжевый.
Стрелками отмечено добавление к суспензии симбиосом 2 мкМ валиномицина, 2 мкМ FCCP, 1 мкМ ниге-рицина, 5 мМ (NH4J2SO4 и 30 мМ K2SO4. Симбиосомы добавлены в количестве, эквивалентном их содержанию в 50 мкг общего белка.
Остальные реактивы - отечественного производства квалификации х. ч.
Все эксперименты были повторены по меньшей мере три раза на трех различных препаратах симбиосом и бактероидов. На рисунках представлены типичные кинетические кривые, отражающие временной ход наблюдаемых процессов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее было показано, что в бескалиевой среде К+-содержащие везикулы ПБМ из корневых клубеньков люпина желтого претерпевают закисле-ние их внутренней водной фазы, которое существенно ускоряется как протонофорами,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.