НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 2, с. 153-159
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.25
ИЗМЕНЕНИЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ПОВЕДЕНИЯ И ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ЖдР В КЛЕТКАХ МОЗГА КРЫС ПОСЛЕ РАННЕГО ПОСТНАТАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА © 2015 г. Е. А. Вениаминова, О. Е. Зубарева*
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" СЗО РАМН, Санкт-Петербург
Нарушения когнитивных функций детей и подростков часто являются следствием инфекционных заболеваний, перенесенных в раннем возрасте. Предполагается, что одним из механизмов этих нарушений может быть изменение в клетках мозга продукции белков, вовлеченных в регуляцию процессов нейропластичности. Одним из таких белков является основной фактор роста фибробластов (РОР2). В данной работе у крыс, которым вводили бактериальный липополисахарид в дозе 25 мкг/кг на 14-е, 16-е и 18-е сутки жизни в возрасте 22 и 23 дней, были исследованы соответственно поведение в "Открытом поле" и продукция мРНК РОР2 в клетках медиальной префронтальной коры, вентрального и дорзального отделов гиппокампа и миндалины. Выявлено подавление исследовательской активности и усиление движения на месте по сравнению с интактными крысами и контрольными животными, которым вводили апирогенный физиологический раствор. Нарушения поведения сопровождались снижением экспрессии гена ¥^2 в клетках медиальной префронтальной коры (по сравнению с интактными крысами).
Ключевые слова: бактериальный липополисахарид, исследовательское поведение, основной фактор роста фибробластов, мРНК, ранний постнатальный онтогенез.
Б01: 10.7868/81027813315020107
ВВЕДЕНИЕ
Когнитивные расстройства (внимания, памяти и др.) представляют одну из основных проблем неврологии и психиатрии детского возраста, поскольку они чрезвычайно распространены (до 20% детей и подростков [1]) и сложно поддаются лечению (что во многом связано с недостаточной изученностью их патофизиологических механизмов).
Одной из главных причин развития когнитивных нарушений у детей и подростков являются инфекционные заболевания, перенесенные ими внутриутробно или в раннем возрасте [1]. В эксперименте подобные патологические состояния могут быть смоделированы с помощью элемента клеточной стенки грамотрицательных бактерий — ли-пополисахарида (ЛПС, эндотоксина). Введение ЛПС крысам и мышам в первые дни жизни приводит к нарушению дифференцировки клеток гип-покампа [2], вызывает отсроченные (наблюдаемые в подростковом и взрослом возрасте) нарушения памяти и изменения исследовательского поведе-
*Адресат для корреспонденции: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12; тел.: (812) 234-34-75; e-mail: zubarevaoe@mail.ru.
ния [3—5]. У потомства крыс, которым вводили эндотоксин во время беременности, отмечаются нарушения долговременной потенциации и нейро-генеза в клетках гиппокампа [6, 7].
Характер названных ЛПС-индуцированных нарушений позволяет предполагать одной из их причин изменение продукции в клетках мозга белков, которые, с одной стороны, влияют на развитие нервных клеток в раннем онтогенезе, с другой стороны, вовлечены в регуляцию мозговых процессов нейропластичности у взрослых.
В проведенном исследовании это предположение проверено в отношении фактора роста фиб-робластов-2 (основной фактор роста фибробластов, РОР2). Этот белок, продуцируемый в мозге в основном астроцитами, является нейротрофиче-ским фактором, регулирующим развитие нервной системы, регенеративную пластичность и нейро-генез у взрослых (обзор — [8]). Изменение продукции РОР2 рассматривается как один из ключевых механизмов, опосредующих влияние неблагоприятных факторов окружающей среды, действующих на ранних этапах онтогенеза, на развитие мозга [9]. РОР2 влияет на активность поведения в
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов исследуемых генов
Gapdh Прямой праймер Обратный праймер Зонд 5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3' 5 '-GGATGCAGGGATGATGTTC-3' 5'-HEX-ATCACGCCACAGCTTTCCAGA-BHQ1-3'
Fgf2 Прямой праймер Обратный праймер 5'-TCAAGGATCCCAAGCGGCTCTACT-3' 5 '-CACTCCCTTGATGGACACAAC-3'
новой среде [10]. Он вовлечен в регуляцию мозговых механизмов нейропластичности, обучения и памяти [11—13].
Целью данной работы явилось изучение особенностей поведения в новой среде и экспрессии гена Fgf2 в клетках структур мозга, вовлеченных в реализацию когнитивных функций (медиальной префронтальной коры, базолатерального ядра миндалины, дорзального и вентрального отделов гиппокампа) у крыс, которым вводили ЛПС в раннем постнатальном онтогенезе. Дифференциальный анализ продукции мРНК FGF2 в двух областях гиппокампа был необходим в связи с их различной ролью в некоторых видах обучения [14] и большей чувствительностью клеток дорзального (по сравнению с вентральным) отдела гиппокампа к неонатальным введениям ЛПС [15].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на 44 крысятах породы Wistar, самцах, с соблюдением принципов гуманности (Директивы Европейского Сообщества №86/609 ЕС), одобренных комиссией по биомедицинской этике НИИЭМ СЗО РАМН. Детеныши крыс содержались в стандартных условиях со своими матерями (одна самка с приплодом в клетке), при свободном доступе к воде и пище. Крысят в каждом помете выравнивали по количеству. Часть молодых самок оставляли, но в эксперименте не использовали. Самцов в каждом помете делили на три группы, которым вводили соответственно бактериальный липополисахарид (ЛПС, эндотоксин, Escherichia coli 055:B5, Sigma) в дозе 25 мкг/кг (экспериментальная группа), апирогенный физиологический раствор (контрольная группа), либо не вводили ничего (ин-тактная группа). Введения осуществляли курсом, один раз в день, на 14-й, 16-й и 18-й дни жизни. Сроки введения были выбраны как критические для действия HH-1ß на формирующиеся когнитивные функции мозга [16]. По уровню развития центральной нервной системы данный возраст крыс соответствует перинатальному периоду у человека [17]. Доза эндотоксина 25 мкг/кг была подобрана в отдельном эксперименте по пироген-ной реакции как умеренно пирогенная.
С целью изучения отсроченного действия введений ЛПС на исследовательское поведение жи-
вотных, в возрасте 22 дней они были протестированы в тесте "Открытое поле". Использовано круглое "Открытое поле", расчерченное на квадраты 20 х 20 см, на пересечении которых находились отверстия в полу — норки. Длительность теста — 3 мин. Для фиксации и анализа результатов теста использована компьютерная программа "Field 4", разработанная в Физиологическом отделе им. И.П. Павлова НИИЭМ РАМН. Анализировали показатели двигательной активности (локомоции и движения на месте), тревожности (груминг, вертикальные стойки, фризинг), и исследовательской активности (обнюхивание, обследование норок и стойки с упором).
Через сутки после тестирования в "Открытом поле" у части крыс, отобранных в случайном порядке, выделяли мозг, немедленно замораживали и хранили при температуре —70°С. Медиальную префронтальную кору, дорзальный и вентральный отделы гиппокампа и миндалину выделяли на срезах, производимых на микротоме-криоста-те согласно атласу Paxinos, Watson [18]. Схема выделения структур представлена на рисунке. Выделение тотальной РНК из клеток мозга проводили методом кислой гуанидинизоцианат-фенол-хло-роформной экстракции с использованием реагента TRI (Molecular Research Center, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Обратную транскрипцию выполняли с использованием олиго dT-праймеров (Медиген, Россия) и MMLV-обратной транскриптазы (Promega, США). Уровень экспрессии генов определяли методом ПЦР в режиме реального времени на ам-плификаторе T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad, США). В качестве референсного использовали ген Gapdh. Технология SYBR Green была использована для исследования эксперссии гена Fgf2 (GenBank NM_019305), технология TaqMan — для выявления уровня мРНК референсного гена Gapdh (GenBank NM_017008). Последовательности использованных праймеров и зонда представлены в табл. 1. Они были синтезированы ООО "Бигль" (Санкт-Петербург, Россия). Анализ каждой пробы проводили в двух параллелях. При использовании SYBR Green после прохождения ПЦР проводили анализ кривых плавления. Относительная продукция мРНК FGF2 рассчитывалась по методу 2-AACt [19].
Дорзальный гиппокамп Вентральный гиппокамп
— 1.88 мм от брегмы
—4.52 мм от брегмы
3.20 мм от брегмы
2.20 мм от брегмы
—4.16 мм от брегмы
—5.60 мм от брегмы
—2.80 мм от брегмы
—3.60 мм от брегмы
Схема выделения структур мозга по атласу Paxinos, Watson [18] (выделяемые области отмечены серым цветом).
Статистическую обработку данных выполняли с помощью компьютерных программ Statistica 5.0. и SPSS 16.0. Проверку нормальности распределения проводили с помощью критерия Лиллиефор-са. Поскольку распределение данных ряда показателей поведения и результатов ОТ-ПЦР в некоторых группах не подчинялось нормальному закону, для сравнения групп применяли методы непараметрической статистики — ^-критерий Крускала—Уоллиса с последующим попарным сравнением групп с помощью ^-критерия Манна—Уитни с поправкой Бонферрони на множественные сравнения. Различия считали достовер-
ными прир < 0.05. Данные в таблицах представлены в виде медианы и квартилей.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Введение ЛПС не оказывало значимого влияния на общее развитие крысят: динамика веса животных в процессе введения препаратов существенно не различалась, в частности, на 23-и сут жизни вес в контрольной группе с введением физиологического раствора составлял 39.0 ± 2.3 г, а в экспериментальной группе 38.6 ± 2.4 г. К 16-му дню жизни глаза открывались более чем у половины интактных, контрольных и экспериментальных
Таблица 2. Показатели поведения в экспериментальных и контрольных группах в тесте "Открытое поле"
Группы животных Критерий Крускала—Уоллиса
Паттерны Показатели интактная (п = 14) контрольная, физ. р-р (п = 15) экспериментальная, ЛПС, 25 мкг/кг (п = 15) Н = р =
Обследование норок Количество актов 9.0 (7.0; 13.3) 7.0 (7.0; 9.0) 8.0 (5.0; 10.0) 2.8 0.245
Общее время (с) 12.4 (8.7; 3.2) 9.1 (8.0; 14.5) 5.7 (3.7; 8.3)*# 13.1 0.00
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.