УДК 577.353.2
ИЗМЕНЕНИЯ ИЗОФОРМНОГО СОСТАВА, СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ТАЙТИНА
СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ МОНГОЛЬСКОЙ ПЕСЧАНКИ (Meriones unguiculatus) ПОСЛЕ ПРЕБЫВАНИЯ В УСЛОВИЯХ РЕАЛЬНОЙ НЕВЕСОМОСТИ*
© 2011 г. И.М. Вихлянцев1**, А.Д. Окунева12, М.Д. Шпагина1, Ю.В. Шумилина1, Н.В. Молочков1, Н.Н. Салмов1, З.А. Подлубная1,2
1 Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино Московской обл. ул. Институтская, 3; факс: (496)733-0553, электронная почта: vikhlyantsev@iteb.ru
2 Пущинский государственный университет, 142290 Пущино Московской обл.
Поступила в редакцию 09.09.11 После доработки 03.10.11
Исследованы изменения изоформного состава, вторичной структуры и степени фосфорилирования тайтина сердечной мышцы монгольских песчанок (Meriones unguiculatus) после 12-суточного пребывания на борту российского космического аппарата «Фотон-МЗ». Изучено влияние тайтина на актин-активируемую АТРазную активность миозина при pCa 7,5 и 4,6. На электрофореграммах сердечной мышцы левого желудочка песчанок полетной группы зарегистрировано почти двукратное увеличение содержания длинной №ВА-изоформы тайтина по отношению к содержанию короткой №В-изоформы этого белка. Обнаружены различия во вторичной структуре тайтина, выделенного из сердечной мышцы песчанок контрольной и полетной групп. Показано увеличение степени фосфорилирования (в 1,3—1,35 раза) тайтина сердечной мышцы песчанок группы «полет». Выявлено снижение активирующего эффекта тайтина сердечной мышцы песчанок группы «полет» на АТРазную активность актомиозина in vitro. Обнаруженные изменения обсуждаются в контексте адаптации сердечной мышцы монгольских песчанок к условиям реальной невесомости.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: монгольская песчанка (Meriones unguiculatus), сердечная мышца, невесомость, изоформы тайтина, актин-активируемая АТРазная активность миозина.
Известно, что пребывание человека и животных в условиях реальной или моделируемой (антиортостатическая постельная гипокинезия, «сухая» иммерсия, модель вывешивания) микрогравитации приводит к развитию в скелетных мышцах «гипогравитационного мышечного синдрома» [1], который сопровождается значительными морфо-функциональными изменениями: атрофией мышечных волокон как медлен-
Принятые сокращения: АМ — актомиозин; АТРаза — аденозинтрифосфатаза; ЛЖ — левый желудочек сердца; ЛЦ — легкие цепи миозина; С1 — субфрагмент-1 миозина; ТЦМ — тяжелые цепи миозина; Pj — неорганический фосфат.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 11-259, 13.11.2011.
** Адресат для корреспонденции.
ного, так и быстрого типа [2, 3], деструктивными изменениями в тонких нитях [3], повышенной деградацией тяжелых цепей миозина [4], снижением содержания белков саркомерного цитоскелета, в частности, М2А-изоформы тайтина (титина) [5—10], нарушением целостности дистрофинового слоя сарколеммальной мембраны [11], дезорганизацией десминовых фила-ментов [12], увеличением объема экстрацеллю-лярного матрикса [13] и трансформацией мио-зинового фенотипа в сторону увеличения доли быстрых изоформ тяжелых цепей миозина [3, 14]. В наших исследованиях было также обнаружено снижение содержания или полное разрушение новой, открытой нами [15], более высокомолекулярной изоформы тайтина в мышце 8о1еш человека и крысы [16, 17] в условиях моделируемой микрогравитации.
1629
Данные о морфологических изменениях в миокарде человека и животных, а также изменениях структурно-функциональных свойств белков сердечной мышцы в условиях микрогравитации немногочисленны. Существуют данные, свидетельствующие как об атрофии сердечной мышцы человека и животных в условиях реальной или моделируемой микрогравитации [18—21], так и об ее отсутствии [22, 23]. Показано, что в миокарде крыс после 14-суточного моделирования гравитационной разгрузки (модель вывешивания) наблюдается уменьшение содержания коннексина 43 (белка межклеточных щелевых контактов), что, по мнению авторов, вносит вклад в развитие сердечной аритмии [24]. В другом исследовании в сердечной мышце вывешенных крыс обнаружили увеличение содержания протеолитического фрагмента тропонина I, что сопровождалось снижением силы и скорости сокращения сердечной мышцы [25]. При этом не выявлено изменений в экспрессии тяжелых цепей миозина, тропомиозина и тропонина Т в сердечной мышце вывешенных крыс. Ранее нами не было обнаружено изменений в содержании С-белка, легких (ЛЦ1 и ЛЦ2) и тяжелых (а- и р-изоформ) цепей миозина в миокарде монгольских песчанок (Шепопея ыщшеыШ-Ыя) после их 12-суточного пребывания в условиях реальной микрогравитации [26].
Цель данной работы заключалась в исследовании изменений изоформного состава и структурно-функциональных свойств тайтина сердечной мышцы монгольских песчанок после 12-суточного пребывания в условиях реальной невесомости на борту российского космического аппарата «Фотон-МЗ».
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для экспериментов были отобраны 12 песчанок (возраст 4—4,5 месяца, средняя масса 51,6 г), разделенных на две группы: «полет» и «контроль». Песчанки группы «полет» (п = 6) в течение 12 суток подвергались действию реальной невесомости на борту российского космическо-
го аппарата «Фотон-МЗ». Песчанки группы «контроль» (n = 6) в это же время содержались в условиях земной гравитации. Животные обеих групп были помещены в специально оборудованный модуль «Контур-Л», состоящий из герметичного контейнера-клетки для содержания животных и системы их жизнеобеспечения. Клетка снабжена кормушкой, конструкция которой обеспечивала животным свободный доступ к корму в виде брикетов с 18-20%-ным содержанием воды, что соответствовало содержанию влаги в растительном корме, поедаемом песчанками в природе. Все процедуры, связанные с содержанием и забоем животных, проводили в ГНЦ РФ — ИМБП РАН и были одобрены комиссией по биомедицинской этике. Экспериментальный материал от животных полетной и контрольной групп был взят через сутки после приземления спутника. Образцы левого желудочка сердца песчанок замораживали в жидком азоте непосредственно после забоя животного, а затем хранили в кельвинаторе «Sanyo» (Япония) при температуре —80°.
Для электрофоретического разделения высокомолекулярных форм тайтина (молекулярная масса 2000—3700 кДа) в ПААГ в присутствии Ds-Na использовали крупнопористый гель с содержанием 2,0-2,3%-ного ПААГ и 0,5-0,6%-ной агарозы, приготовленный по описанному методу [27]. Электрофорез проводили в аппаратах с вертикальным расположением геля (ООО «Хе-ликон», Россия и «C.B.S. Scientific Co.», США), размер пластинки геля 8 х 10 см. Денситомет-рию гелей проводили с помощью компьютерной программы Total Lab v1.11. Содержание тай-тина оценивали по отношению к содержанию тяжелых цепей миозина. В табл. 1 приведены средние арифметические величины соотношений интегральных плотностей соответствующих белковых полос на гелях и их ошибки. Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна— Уитни. Значимыми считались различия с уровнем достоверностиp < 0,05.
Вестерн-блоттинг тайтина проводили по описанному методу [28] с нашими модификаци-
Таблица 1. Содержание тайтина в левом желудочке сердца песчанок контрольной и полетной групп
Вариант NT/ТЦМ ШВА/ТЦМ ШВ/ТЦМ N2BA/N2B Т2/ТЦМ
Контроль (n = 6) Полет (n = 6) 0,016 ± 0,003 0,017 ± 0,002 0,027 ± 0,003 0,048 ± 0,004* 0,078 ± 0,006 0,070 ± 0,007 0,352 ± 0,037 0,682 ± 0,049* 0,032 ± 0,003 0,038 ± 0,005
* Уровень значимостиp < 0,05 (сравнение с контрольной группой).
ями [17]. Перенос белка из ПААГ на PVDF мембрану («Millipore», США) после электрофореза проводили в трис-глицин/метанольном буфере с добавлением Ds-Na при силе тока 0,8— 1,0 мА/см2 в течение 48—72 ч при постоянном охлаждении. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела AB5 к участку молекулы тайтина в А-диске, расположенному около М-линии саркомера [29], любезно предоставленные Л. Цховребовой и Дж. Три-ником (Institute for Molecular and Cellular Biology and Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, Великобритания). В качестве вторичных антител, конъюгированных с перок-сидазой хрена, использовали антитела против IgG мышей («Sigma», США). Белковые полосы выявляли с помощью 3,3'-диаминобензидина.
Чистоту выделенных препаратов тайтина из левого желудочка (ЛЖ) сердца монгольских песчанок, полученных по методу Триника с со-авт. [30], тестировали с помощью электрофореза в 7%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na [31].
Выпрямленные одиночные молекулы тайти-на получали по методу Цховребовой и Триника [32] с незначительными модификациями. Каплю раствора, содержащего 50%-ный глицерин, 0,5 М KCl, 15 мМ фосфатный буфер, рН 7,0, и тайтин с концентрацией 0,05 мг/мл, распыляли на слюду, которую укрепляли горизонтально на диске (радиус 4,8 см), помещенном на вал ротора центрифуги СМ-50 («ELMI», Латвия). Центрифугировали 20—30 с при 10 000 об/мин. Слюду с образцом после высушивания в вакуумной установке, разработанной в ИТЭБ РАН (Россия), напыляли платиной под углом 30° с вращением, а затем углеродом под углом 90°. Реплику снимали на бидистиллированную воду и помещали на медные сеточки. Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе JEM-100В (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении х20 000—40 000. Длину выпрямленных молекул тайтина подсчитывали с использованием программного обеспечения Axio Vision LE 4.8.2.
Спектры КД регистрировали на приборе J815 CD Spectrometer фирмы «Jasko» (Япония). Измерения проводили при 4° в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 мм в буфере, содержащем 0,6 М KCl, 30 мМ KH2PO4, 1 мМ ДТТ, рН 7,0. Объем раствора составлял 200 мкл. Использовали препараты тайтина с концентрацией 0,1 мг/мл. Вторичную структуру белков рассчитывали с помощью модуля CONTINLL программы CDPro [33].
Для изучения in vitro влияния тайтина сердечной мышцы песчанок полетной и контрольной групп на актин-активируемую АТРазную
активность миозина при pCa 7,5 и 4,6 использовали миозин сердечной мышцы кролика,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.