БИОФИЗИКА, 2012, том 57, вып. 5, с. 756-763
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.353
ИЗМЕНЕНИЯ ИЗОФОРМНОГО СО СТАВА ТАЙТИНА И ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ МОНГОЛЬСКОЙ ПЕСЧАНКИ (Meriones unguiculatus) ПОСЛЕ 12-СУТОЧНОГО КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА
© 2012 г. А.Д. Окунева* ***, И.М. Вихлянцев*, М.Д. Шпагина*, В.В. Рогачевский* **, С.С. Хуцян* **, З.А. Подлубная* ***, А.И. Григорьев ****
* Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3;
E-mail: a-okyneva@yandex.ru ** Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3;
*** Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, просп. Науки, 3 **** Государственный научный центр - Институт медико-биологических проблем РАН,
123007, Москва, Xорошевское ш., 76 Поступила в p едакцию 18.06.12 г.
П роведены исследования изменений изоформного состава тайтина и тяжелых цепей миозина скелетных мышц (m. soleus, m. gastrocnemius, m. tibialis anterior, m. psoas major) монгольской песчанки (Meriones ungui€ulatus) после 12-суточного пребывания в условиях реальной микрогравитации на борту российского космического аппарата «Фотон-М 3». В m. psoas и m. soleus песчанок группы «полет» обнаружены ожидаемые изменения изоформного состава тяжелых цепей миозина в сторону увеличения содержания быстрых его изоформ (IIx/d и IIa соответственно). Не обнаружено достоверных отличий в содержании IIa и Пх/d изоформ тяжелых цепей миозина в m. tibialis anterior песчанок контрольной и полетной групп. Выявлено неожиданное увеличение содержания медленной I изоформы тяжелых цепей миозина при снижении содержания быстрой Пх/d изоформы в m. gastromemius песчанок полетной группы. В скелетных мышцах песчанки группы «полет» обнаружено снижение (в 1,2-1,7 раза) относительного содержания N2A-изофоpмы тайтина при сохранении содержания его NT-изоформы, открытой нами ранее в поперечно-полосатых мышц млекопитающих. Уменьшение содержания N2A-изофоpмы тайтина не приводило к ожидаемым нарушениям саркомерной структуры и сократительной способности скелетных мышц песчанки полетной группы. Выдвинуто предположение о ведущей роли NT-изоформ тайтина в поддержании структурно-функциональных свойств поперечно-полосатых мышц млекопитающих.
Ключевые слова: тайтин, тяжелые цепи миозина, микрогравитация, скелетные мышцы.
Известно, что пребывание человека и животных в условиях реальной или моделир уемой микрогравитации сопровождается изменениями в функционировании разных систем организма [1]. Комплекс этих изменений в скелетных мышцах получил название «гипогравитационного мышечного синдрома» (ГМС) [1]. При кратко-временны х (2-5 сут) воздействиях микр ограви-тации он проявляется в снижении мышечного тонуса и силы мышечных сокращений, выраженных преимущественно в гравитационной
Сокращение: ТЦМ - тяжелые цепи миозина.
мускулатуре ног и туловища [1,2]. При более длительных воздействиях микрогравитации эти нар ушения осложняются р азвитием мышечной атр офии, сопровождающейся уменьшением объема мышечных волокон как медленного, так и быстрого типов [3,4], деструктивными изменениями в толстых и тонких нитях [4-6], снижением содержания белков саркомерного цито-скелета, в частности небулина и Х-белка [7,8], и другими изменениями. Показано, что наряду с этим в условиях моделируемой и реальной микрогравитации в разгруженной мышце 8о1еи8 человека и животных уменьшается доля воло-
кон, содержащих медленные изоформы тяжелых цепей миозина (ТЦМ), и увеличивается доля волокон с преобладанием быстрых изоформ ТЦМ [4,9-13]. Эти изменения являются следствием как более значительной атрофии медленных волокон [9], так и усиления синтеза быстрых изоформ миозина в условиях микрогравитации [13].
Наряду с вышеописанными изменениями об-нар ужено уменьшение содер жания К2Л- [14-17] и КТ- [18,19] изоформ тайтина т. 8о1еи8 крысы и человека после пребывания в условиях моделируемой микрогравитации. Уменьшение со -держания интактных изоформ тайтина сопро-вождалось снижением пассивного натяжения, развиваемого мышцей 8о1еи8 пр и растяжении [14] и нарушениями ее саркомерной стр уктуры и сокр атительной функции [16,17,19-21]. П ред-полагается, что основной вклад в вышеописанные нарушения структуры и функциональных свойств т. 8о1еи вносит уменьшение содержания не К2Л-, а КТ-изоформы тайтина [22,23]. Исследования трансформаций изоформного со -става тайтина и их вклада в изменения структур но-функциональных свойств скелетных мышц млекопитающих в условиях реальной микрогравитации не проводились. Ранее мы показали, что изменение изоформного со става, вторичной структуры и степени фосфорилиро -вания тайтина сердечной мышцы вносит вклад в адаптацию миокарда монгольской песчанки к условиям реальной микрогравитации [24,25]. В данной работе пр оведено изучение изменений изоформного состава тайтина скелетных мышц монгольской песчанки (Мвпопвъ ыщшсыШш) после 12-суточного космического полета с целью выявления роли этих изменений в функционировании указанных мышц. Отдельной задачей являлось сравнительное изучение изменений изофор много со става тяжелых цепей миозина в скелетных мышцах песчанок контрольной и полетной групп.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальный материал. Объектом исследования служили 12 песчанок в возрасте 4,0-4,5 месяца (ср едняя масса 51,6 г), р азделен-ных на группы «полет» и «контр оль». Песчанки группы «полет» (п = 6) в течение 12 сут подвергались действию реальной микрогравитации на борту космического аппарата «Фотон-М3» Песчанки гр уппы «контроль» (п = 6) в это же время содер жались в условиях земной гравитации. Животные обеих групп были помещены в модуль «Контур-Л», состоящий из герметичного контейнера-клетки для содержания животных с системой их жизнеобеспечения. Клетка
была снабжена кормушкой, конструкция которой обеспечивала животным свободный доступ к корму в виде бр икетов с 18-20%-м содержанием воды, что соответствовало содержанию влаги в растительном корме, поедаемом песчанками в природе. Все процедуры, связанные с содержанием и забоем животных, проводились в ГНЦ РФ - ИМБП РАН и были одобрены комиссией по биомедицинской этике. Экспериментальный материал от животных полетной и контрольной групп был взят через сутки после приземления спутника. Образцы скелетных мышц (m. soleus, m. gastromemius, m. tibialis anterior, m. psoas major) песчанок замораживались в жидком азоте непосредственно после забоя животного, а затем хранились в кельви-наторе «Sanyo» (Япония) при температуре минус 80°C.
ДСН-гель-электрофорез тайтина и тяжёлых цепей миозина. Для электрофоретического разделения высокомолекулярных изоформ тайтина использовали 2,0-2,3% полиакриламидный гель (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36,5:1,0) с 0,5-0,6% содержанием агар озы и 0,1% ДCН, приготовленный по методу [26] с модификациями [19]. Электрофор етическое разделение тяжелых цепей миозина проводили по методу disc-электpофоpеза [27] с концентрацией полиакриламида 7% в концентрирующем и 4% в разделяющем гелях. ДCН-гель-электрофорез проводили в аппар атах с вертикальным ра спо-ложением геля (ООО «Хеликон», Россия и C.B.S. S^endf^ Co, CША, размер пластинки геля 8 x 10 см). Денситометрию тайтина и тяжелых цепей миозина проводили с помощью компьютерной программы Total Lab v1.11. ^-держание тайтина оценивали по отношению к содер жанию тяжелых цепей миозина. Cтатиcти-ческую обработку проводили с использованием непараметр ического U-кр итерия Манна-Уитни. Значимыми считали различия с уровнем достоверности p < 0,05.
Срезовая электронная микроскопия. Образцы мышц, замороженные в жидком азоте и хр анившиеся при температуре -80°C, фиксиро -вали в 2,5% тетраоксиде осмия, растворенном в ацетоне в течение 5 сут при -50°C. Затем образцы обезвоживались в 100% ацетоне в течение 10-15 мин. П р оцедура повторялась трижды. Далее образцы заливали в смесь смол Epon-Araldite и выдерживали 3 сут при температуре 60oC для полимеризации. Приготовление срезов осуществлялось на ультратоме UC-6 (Lerca, Германия). Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе Libra 120 при ускоряющем напряжении 120 кВ и увеличении 10000х. Увеличение микроскопа тестировалось
Рис. 1. Изменения изоформного состава тайтина в камбаловидной мышце (т. 8о1еш) песчанок. Светлые столбики - контроль, темные - группа «полет».
Рис. 2. Изменения изоформного состава тайтина в икроножной мышце (т. gastrocnemius) песчанок. Обозначения, как на р ис. 1.
Рис. 3. Изменения изоформного состава тайтина в передней большеберцовой мышце (m. tibialis anterior) песчанок. Обозначения, как на рис. 1.
Рис. 4. Изменения изоформного состава тайтина в большой поясничной мышце (m. psoas major) песчанок. Обозначения, как на р ис. 1.
по паракристаллам парамиозина с периодичностью 14,5 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изменения изоформного состава тайтина скелетных мышц песчанок в условиях невесомости.
Учитывая полученные ранее результаты по снижению содержания интактных КТ- и К2Л-изо-форм тайтина в т. so1eus человека и крысы в условиях моделируемой микрогравитации [1420], мы ожидали обнаружить подобные изменения и в скелетных мышцах песчанок после космического полета. Однако р езультаты про -веденных нами исследований не выявили снижения содержания КТ-изоформы тайтина ни в одной из исследованных скелетных мышцах песчанок группы «полет» по сравнению с контрольной группой (рис. 1-5). Более того, в т. gastrocnemius песчанок полетной группы обна-
ружено почти двукратное увеличение содержания NT-изоформы тайтина (рис. 2; рис. 5, дорожки 3,4). На фоне этих изменений выявлено ожидаемое уменьшение содержания N2A-изо-формы тайтина в m. psoas ~ в 1,7 раз (рис. 4) и в m. soleus (рис. 1), m. gastrocnemius (рис. 2), m. tibialis anterior (рис. 3) в среднем в ~ 1,2—1,3 раза у песчанок группы «полет». Однако это снижение (в m. soleus, m. gastrocnemius, m. tibialis anterior)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.