ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 555-562
УДК 581.1
ИЗМЕНЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДНОГО СОСТАВА АПЕКСА ПОБЕГА Crocus sativus В ХОДЕ ОНТОГЕНЕЗА
© 2004 г. П. Абришамчи, Т. Раджабиан*, X. Ебрахимзаде**
Кафедра биологии, факультет науки, Университет им. Фердоуси, Мешхед, Иран * Кафедра биологии, факультет науки, Шахед Университет, Тегеран, Иран ** Кафедра биологии, факультет науки, Университет Тегерана, Тегеран, Иран Поступила в редакцию 14.01.2003 г.
Развитие апекса побега во время жизненного цикла Crocus sativus L. характеризовали с помощью световой микроскопии и двумерного гель-электрофореза в ПААГе. Используя окрашивание гелей серебром, мы наблюдали множественные количественные и качественные изменения полипептидов при переходе апекса от вегетативной к префлоральной и от префлоральной к флоральной фазе развития. При нанесении 80 мкг белка мы были способны различить 352 пятна полипептидов. При переходе от вегетативной к префлоральной фазе в меристеме появлялось 89 новых полипептидов, а 29 полипептидов исчезало. В репродуктивной меристеме появлялось 94 новых пятна, а 44 исчезало. Таким образом, в период, когда развитие растения нельзя повернуть вспять, т.е. на префлоральной стадии развития, предшествующей появлению зачатков цветков, происходят заметные количественные и качественные изменения в составе полипептидов.
Crocus sativus - префлоральная меристема - репродуктивная меристема - верхушка побега - двумерный гель-электрофорез
Считается, что для перехода меристемы побега от вегетативного к репродуктивному состоянию необходима экспрессия новой генетической информации [1]. При зацветании активируются некоторые гены, которые были неактивны в период вегетативного роста. Экспрессия этих генов приводит к синтезу новых белков цветения, которых не было в вегетирующих растениях [2, 3]. Начиная с 1960-х годов, исследователи пытались определить время, когда можно заметить такие изменения в экспрессии генов (и/или в синтезе белков) в апикальной меристеме. Такие попытки предпринимались для Pharbitis nil [4, 5], Xanthium [6], Tulipa [7] и Chenopodium [8].
Crocus sativus (шафран) - многолетнее травянистое растение из семейства Iridaceae. Оно не размножается половым путем [9], а только вегетативно, клубнелуковицами [10]. Для зацветания шафрана неважен световой режим. Возможность цветения исключительно зависит от запасных веществ в клубнелуковице [11]. Ряд аспектов роста шафрана, включая дифференцировку цветков, изучали ранее [12, 13]. В частности, были прове-
«г-
.* i •« .
*
Г
\ * % * *
Сокращение: 2Б-ПАГЕ - двумерный электрофорез в поли-акриламидном геле.
Адрес для корреспонденции: P. Abrishamchi. Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University, Mashad, Iran. E-mail: pabrishamchi@excite.com; abrisham@ferdowsi.um.ac.ir
Рис. 1. Вегетативная меристема на ранней стадии развития с 2-3 слоями туники (т) и небольшим по объему корпусом (к). 1 - апикальная зона; 2 - латеральная зона; 3 - жилка. Антиклинальные деления клеток туники (стрелка) и периклинальные деления в слое под туникой (сдвоенная стрелка) в латеральной зоне меристемы образуют зачаток кроющей чешуйки (х400).
Рис. 2. Вегетативная меристема на стадии образования листьев (указаны стрелками) (х160).
дены исследования онтогенетических изменений растворимых белков методом одномерного гель-электрофореза [14]. В продолжение этих исследований мы провели морфологическое и биохимическое исследование меристем побегов шафрана. Применив двумерный электрофорез в ПААГе с высоким разрешением, мы сравнили растворимые белки апексов побегов в период перехода к цветению, а именно, на стадиях вегетативного, префло-рального и флорального развития. Такой анализ позволяет получить новую информацию об изменениях в экспрессии генов.
МЕТОДИКА
Клубнелуковицы шафрана (Crocus sativus L.) собирали на полях Натанца (провинция Исфахан) в середине мая, середине июня, середине июля, затем с интервалом в неделю до начала августа и с интервалом трое суток до начала сентября. Апикальные почки вырезали и немедленно фиксировали в смеси формальдегида, уксусной кислоты и этанола. Материал инфильтрировали и заливали в парафин после стандартной проводки через ряд растворителей от этанола до толуола.
Рис. 4. Плоский апекс в конце префлоральной фазы (х200).
Рис. 5. Флоральный апекс с зачатками околоцветника (зо) и тычинок (зт).
Рис. 6. Флоральный апекс с хорошо дифференцированными зачатками тычинок (зт) по обе стороны от гнезда завязи (гз). Митотическая активность в основании этого гнезда приводит к образованию зачатков плодолистиков (пл) (указаны стрелкой) (х200).
Рис. 7. Бутон: тч - тычинка; пл - плодолистик; о - околоцветник; ц - цветонос; пц - прицветники; л - листья (х80).
Продольные срезы толщиной в 7 микрон окрашивали гематоксилином по Harris [15].
Для электрофореза белков апикальные почки замораживали и хранили при -70°С. Замороженные ткани растирали в предварительно охлажден-
Рис. 8. Полностью дифференцированный бутон с только что сформированными семяпочками (х30).
ной ступке с двумя объемами 0.2 М Na-фосфатного буфера, содержащего 1% (вес/объем) поливинилпо-липирролидона. Гомогенат центрифугировали при 27000 g в течение 30 мин при 4°С и супернатант использовали для двумерного гель-электрофореза в ПААГе. Количество белка определяли по Bradford [16]. В первом направлении ПААГ-электрофорез проводили при недиссоциирующих условиях в ступенчатой буферной системе в 10% ПААГ при Т = 30.8% и С = 2.59 [17]. Вертикальный электрофорез образца (80 мкг белка) проводили при силе тока 60 мА на пластину. Во втором направлении проводили электрофорез в 12.5% Na-ДдС-ПААГе в разделяющем геле [18]. После электрофореза в первом направлении из геля вырезали полоски и уравновешивали их в течение 5 мин с 0.125 М Трис-HCl (pH 6.8), содержащем 10% (по объему) глицерина, 5% (вес/объем) Na-ДДС, 0.08% (вес/объем) дитиотрейтола и 0.02% (вес/объем) бромфенолового синего. Пропитанные буфером полоски геля размещали горизонтально поверх концентрирующего геля и соединяли с ним с помощью горячей 0.1%-ной агарозы, растворенной в 0.125 М Трис-HCl, pH 6.8 [19]. Вертикальный электрофорез во втором направлении проводили при постоянном токе (30 мА на пластину). Затем гели фиксировали и окрашивали серебром по Sammons [20]. Полипептиды сравнивали пятно за пятном, используя следующие критерии: электрофоретическую подвижность, форму пятна и интенсивность окраски серебром. Для каждого варианта опыта использовали три геля, соответствующие трем разным белковым препаратам. Представленные рисунки объединяют результаты, полученные на трех гелях. Анализировали только пятна, присутствовавшие во всех трех гелях. Качественными изменениями мы
ПАГЕ
3
^ ""4
^ а А
13
°0 ( 12 -
11
14
15
18
21
35 34 33
л ---- ^^^Ьт4«-—о^
^ _ 29
31
"36 37
О»
'27 32
О
44
53
56 0> ..
59
53
О
к к
I
сЗ £
кД
-66.0
-45.0
■34.7
-24.0
-18.4
14.3
Рис. 9. Двумерный гель-электрофорез растворимых белков из вегетативных почек. Фазо-специфичные белки затемнены и пронумерованы. Стрелки указывают на пятна, интенсивность окраски которых увеличилась при переходе к цветению. Сдвоенные стрелки указывают на пятна, окраска которых ослабевала при переходе к цветению.
6
считали факты появления или исчезновения полипептидов, а изменения интенсивности окраски пятен мы рассматривали как количественные изменения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Апикальная меристема на разных стадиях развития показана на рис. 1-8. После завершения цветения в ноябре близ основания цветоноса на материнской клубнелуковице закладывается новая апикальная меристема, маленькая по размеру и выпуклая по форме, которая начинает быстро увеличиваться в размерах. Эта апикальная меристема имеет простое строение: туника состоит из 2-3 слоев клеток и окружает корпус, не имеющий слоев (рис. 1). На рис. 2 показана куполообразная
вегетативная меристема и несколько зачатков листьев. С середины июля до начала августа апекс продолжал образовывать листовые зачатки, которые развивались в молодые листочки. В период между первой и второй неделей августа апекс достигал префлоральной стадии развития. На рис. 3 можно видеть активированные тунику и корпус в начале этой стадии, когда меристема имела выпуклую форму. Затем она становится плоской (рис. 4). Ее центральная зона с вакуолизированны-ми клетками покрывается зоной активной меристемы, возникшей из туники и корпуса. Начиная со второй недели августа, в этом плоском апексе закладываются и развиваются примордии цветков (рис. 5-8).
На рис. 9-11 представлены результаты двумерного электрофореза в полиакриламидном геле
ПАГЕ
О «
П i
сЗ £
кД |- 66.0
-45.0
-34.7 24.0
-18.4
14.3
Рис. 10. Двумерный гель-электрофорез растворимых белков из префлоральных апексов. Фазо-специфичные белки затемнены. Стрелки указывают на пятна, интенсивность окраски которых увеличивалась при переходе к цветению. Сдвоенные стрелки указывают на пятна, окраска которых ослабевала при переходе к цветению.
(2Б-ПАГЕ) полипептидов из апикальных почек на разных стадиях развития. В случае вегетативного апекса мы различили 242 пятна. 64 мажорных полипептида были характерны для вегетативного апекса; они имели мол. м. между 24 и 66 кД (рис. 9). В случае префлоральной фазы мы различили 302 полипептида. При переходе от вегетативной к префлоральной фазе появилось 89 новых полипептидов и исчезло 29 полипептидов. 89 новых полипептидов имели мол. м. в пределах от 18 до 45 кД (рис. 10). Во флоральной меристеме мы нашли 352 полипептида (рис. 11). Инициация и дифференциация органов цветка в префлоральном апексе сопровождались исчезновением 44 полипептидов. С другой стороны, во флоральной меристеме было найдено 94 полипептида, которых не было в префлоральной меристеме. Большинство новых полипептидов имели мол. м. в диапазоне между 14 и 24 кД. Помимо этих качественных изменений мы наблюдали при переходе к цветению изменения интенсивности окрашивания ряда пятен, характерных для разных стадий развития. Обычно в случае префлоральной и флоральной меристем пятна были ярче, чем в
случа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.