БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 3, с. 206-213
УДК 615.216.2:577.3:612.822.3
ИЗМЕНЕНИЯ ТРАНСМЕМБРАННЫХ ИОННЫХ ТОКОВ НЕЙРОНОВ МОЛЛЮСКОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ СОЕДИНЕНИЯ РГПУ-207
© 2013 г. Ю. Д. Игнатов1, И. Н. Тюренков2, А. И. Вислобоков1*, В. Н. Перфилова2#, И. С. Мокроусов2
1Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова МЗ РФ,
197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6/8; *электронная почта: Vislobokov@yandex.ru 2Волгоградский государственный медицинский университет МЗ РФ, 400131, Волгоград, площадь Павших Борцов, 1; #электронная почта: vnperfilova@mail.ru Поступила в редакцию 15.11.2012 г.
Изучено влияние нового соединения — фенилгидразида (4-фенил-2-пирролидон-1-ил)-уксусной кислоты (лабораторный шифр РГПУ-207) в концентрациях 1, 10, 100 и 1000 мкМ на трансмембранные натриевые, кальциевые и калиевые ионные токи нейронов моллюсков прудовика (Ьутпаеа stag-паИ^) и катушки (Planorbarius ттеш). В концентрации 1 мкМ РГПУ-207 незначительно (4.4 ± 2.0%) увеличивает амплитуду калиевого медленного тока, в более высоких концентрациях подавляет все токи: при 10—1000 мкМ — натриевые, 100—1000 мкМ — калиевые и 1000 мкМ — кальциевые. Преимущественное подавление натриевых и калиевых токов может указывать на некоторую специфичность действия РГПУ-207. Кинетика активации и инактивации натриевых и активации калиевых медленных ионных токов замедляется, что свидетельствует о возможном влиянии соединения на воротные механизмы ионных каналов.
Ключевые слова: Lymnaea stagnalis, Planorbarius corneus, нейроны, ионные токи.
DOI: 10.7868/S0233475513030055
Поверхностная мембрана возбудимых клеток содержит набор ионных каналов, ведущими среди которых являются потенциал-зависимые натриевые, кальциевые и калиевые каналы. При сдвиге внутримембранного электрического поля изменяется проводимость этих каналов, что формирует возбудимость клеток и генерацию ими электрических потенциалов. Функционирование ионных каналов лежит в основе многих физиологических процессов, а ряд заболеваний нервной, сердечно-сосудистой и др. систем связан с нарушением работы ионных каналов и ионного баланса клеток [1—3, 5, 6, 11, 12, 15, 19].
Многие фармакологические средства — анестетики, противоаритмические и противоэпилепти-ческие средства, растительные и животные токсины (аконитин, вератридин, батрахотоксин) — реализуют свое действие через возбудимые клетки нервной и мышечной системы, блокируя ионные каналы [7, 9, 10, 14, 16—18]. Другие препараты активируют ионные каналы, увеличивая амплитуду ионных токов, или незначительно подавляют их. Среди нейротропных средств и иммуно-модуляторов могут встречаться вещества, блоки-
рующие, активирующие или модулирующие ионные каналы.
Ранее мы показали, что фенилгидразид (4-фенил-2-пирролидон-1-ил)-уксусной кислоты (РГПУ-207) [патент РФ № 2440981], синтезированный на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена (Санкт-Петербург), обладает ноотропными, антидепрессивными и анксиолитическими свойствами. Цель данной работы — изучение влияния соединения РГПУ-207 на натриевые, кальциевые и калиевые ионные каналы нейронов моллюсков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования были неидентифици-рованные изолированные нейроны с диаметром 60—100 мкМ брюхоногих моллюсков прудовика большого (Lymnaea stagnalis) — около 80% и катушки роговой (Planorbarius corneus) — около 20% использованных нейронов. Из тела моллюсков вырезали окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое затем для выделения изолирован-
Ионный состав растворов (в мМ) для регистрации ионных токов нейронов моллюсков
Ионные токи №С1 С8С1 СаС12 КС1 Трис-ОН рН
Внеклеточный раствор
Общий входящий ток 100 - 2 1.5 5 5 7.5
Кальциевый входящий ток - 100 10 1.5 - 5 7.5
Натриевый входящий ток 100 - - 1.5 5 5 7.5
Калиевый выходящий ток 100 - 2 1.5 5 5 7.5
Внутриклеточный раствор
Входящие токи - 120 - - - 5 7.4
Калиевые выходящие токи - - - - 120 5 7.4
ных клеток обрабатывали 0.25% раствором смеси трипсина и проназы Е в равном количестве в течение 40—50 мин при температуре 20—22°С и подвергали механическому разделению. Использовали свежевыделенные нейроны (через 60—120 мин после выделения) и на следующий день после их хранения в холодильнике при 4°С.
Исследуемое соединение добавляли в перфу-зирующий раствор. Для измерения трансмембранных ионных токов применяли метод внутриклеточной перфузии изолированных нейронов и фиксации мембранного потенциала [1, 3, 6] с использованием электрофизиологической установки. Адекватность регистрации токов обеспечивали 12-разрядный АЦП—ЦАП — модифицированная стереозвуковая карта С84281 с временем квантования 40 мкс, и усилители авторского исполнения на микросхемах 544УД1 с полосой пропускания от 0 до 10.0 кГц. Усилитель-преобразователь "ток—напряжение" имел в цепи обратной связи резистор 1 МОм, цепь положительной обратной связи частично компенсировала нежелательное влияние последовательного с нейроном сопротивления, понижающего точность поддержания фиксированного мембранного потенциала. Программа для ЦАП с широкими возможностями позволяла формировать последовательности прямоугольных (для оценки амплитуд и кинетики токов или построения вольт-амперных характеристик (ВАХ) мембраны) или пилообразных импульсов (для качественной оценки типа и амплитуд ионных токов).
Микропипетки с порой изготовляли из полиэтиленовой трубки диаметром 1.3 мм и длиной 3 см, ее сгибали У-образно в струе горячего воздуха, и на сгибе тонкой стальной проволокой движением изнутри формировали выступ. Затем на вершине выступа под бинокулярной лупой горячей иглой делали отверстие и соединяли пипетку с системой растворов, а по величине сопротивления (порядка 200—400 кОм) оценивали пригодность микропипетки для дальнейшей работы. Изолирован-
ную клетку помещали на полиэтиленовую пипетку (в большинстве случаев при фиксированном потенциале —90 мВ). При гиперполяризующем сдвиге мембранного потенциала после прорыва мембраны нейрона на экране осциллографа видны емкостные токи и неспецифический ток утечки, который электронным способом вычитали из общего тока. В процессе эксперимента его изменения отслеживали и компенсировали.
При переключении тестирующего импульса на деполяризацию регистрировали входящие (натрий-кальциевые) и выходящие (быстрый и медленный) калиевые токи. После регистрации суммарных ионных токов внутриклеточный и наружный растворы заменяли растворами для регистрации отдельного тока (таблица). Частоту тестирования нейронов при регистрации ионных токов подбирали так, чтобы процессы реактивации каналов успевали закончиться. При регистрации натриевых токов сдвиги потенциала производились не чаще, чем через 10 с; кальциевых токов — через 30 с и калиевых медленных (в зависимости от длительности тестирующего импульса) — через 30—60 с. Для построения ВАХ мембраны как в контроле, так и при действии соединения использовали прямоугольные ступенчатые (по 10 мВ) сдвиги потенциалов. Длительность и шаг тестирующих импульсов для оценки изменений амплитуд токов при действии вещества выбирали такими, чтобы был виден максимум амплитуды токов, найденный при регистрации ВАХ (для натриевых и кальциевых — примерно 10 мс и —10 мВ, 100 мс и —10 или 10 мВ соответственно). Медленные калиевые токи регистрировали при сдвигах потенциала до 30—40 мВ и длительности 100—1000 мс. При необходимости проследить динамику процесса активации и инактивации токов использовали импульсы нужной длительности и регистрировали на одной развертке с различным временем и количеством точек отсчета.
Для исследования использовали соединение РГПУ-207 (фенилгидразид (4-фенил-2-пирроли-
дон-1-уксусной кислоты)), которое растворяли в малом количестве диметилсульфоксида (DMSO), а затем вводили в соответствующие наружные растворы до концентрации 1000 мкМ, подогревали на водяной бане и разбавляли до концентрации 100, 10 или 1 мкМ. Раствор РГПУ-207 с концентрацией 1000 мкМ содержал менее 10 мМ DMSO, что не влияло на ионные каналы. Результаты обрабатывали с использованием статистической программы SPSS-17, для проверки гипотезы о различиях между группами применяли непараметрический дисперсионный анализ Фридмана, а для доказательства различий между контролем и эффектами фармакологических средств в различных концентрациях — апостериорное попарное сравнение с использованием критериев Вилкок-сона. Изменения каждого тока при определенной концентрации оценивали по результатам не менее 10 измерений на разных клетках. На графиках представлены значения средних арифметических и 95% доверительные интервалы, полученные с использованием пакета программ "Excel".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Соединение РГПУ-207 в концентрации 1000 мкМ подавляет натрий-кальциевые и калиевые ионные токи нейронов прудовика и катушки без существенных межвидовых различий. На суммарной кривой токов мембраны показано (рис. Ы, контроль — кривая 1, влияние препарата — кривая 3), что калиевый ток подавлен сильнее по сравнению с контролем (правая часть кривой), чем суммарный входящий (кривая 3 в левой части). На рис. 1Б видно, что РГПУ-207 слабее угнетает кальциевый ток (кривая 2 в правой части), чем натриевый (кривая 2 в левой части). Подробные данные об этих изменениях представлены ниже.
Под действием РГПУ-207 в концентрации 1— 10 мкМ неспецифические токи утечки мембраны незначительно (до 0.3 нА) снижались, а в концентрации 100—1000 мкМ — возрастали (на 0.3—0.6 нА), что указывает на изменения неспецифической проводимости мембраны и, соответственно, на повышение и снижение стабильности мембраны. Поскольку токи утечки переносятся в основном ионами калия, то можно предполагать, что вследствие этого и потенциал покоя нейронов может изменяться.
Амплитуда натриевого тока (на рис. 1В представлен набор кривых для построения ВАХ в контроле) при действии РГПУ-207 в концентрации 1000 мкМ снижалась (рис. 1Га, кривая 2в сравнении с кривой 1 — снижение примерно на 30%). Подобный эффект повторился на этом же нейроне после отмывания соединения (кривая 4 в с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.