БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 6, с. 1101-1107
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 57.085
ИЗМЕНЕНИЯ В ЛИМФОЦИТАХ ПОД ДЕЙСТВИЕМ СУБСТРАТОВ ОКИСЛЕНИЯ
© 2014 г. Н.В. Хундерякова, С.А. Плясунова*, Е.Г. Литвинова, Т.В. Ячкула, М.В. Захарченко, А.В. Ковзан**, Н.И. Федотчева, П.М. Шварцбурд, М.Н. Кондрашова
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3;
*Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева МЗ Р Ф, 119997, Москва, ул. Саморы Машела, 1;
**Красноярский научный центр Сибирского отделения РАН, 660036, Красноярск, А кадемгородок, 50
E-mail: mkondrashova23@inbox.ru
Поступила в p едакцию 30.06.14 г.
И сследованы лимфоциты в мазках крови у детей с онкологическими заболеваниями в сравнении со здоровыми детьми подобранной близкой группы. И спользованы принятый в гематологии способ окрашивания мазка для определения формулы крови и лимфоцитарных индексов и окрашивание по новый методике с часовой инкубацией клеток в биохимической среде для определении активности сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и их отношения, характеризующего взаимодействие дыхания и гликолиза. П ри проведении инкубации в биохимических условиях обнаружено сильное увеличение размеров лимфоцитов при добавлении молочной кислоты в мазках крови больных с опухолями. Такой эффект не наблюдался при добавлении янтарной кислоты, а также в мазках крови здоровых детей из группы сравнения. Изменения структуры клеток у больных были связаны и с изменениями активности исследуемых ферментов. Предлагаемое цитобиохимическое исследование позволяет повысить диагностическую чувствительность при обследовании состояния больных и эффективность лечения при онкологических заболеваниях.
Ключевые слова: лимфоциты, лимфоцитарные индексы, онкология, цитохимия, сукцинатдегидро-геназа, лактатдегидрогеназа, эффект Варбурга, нитросиний тетразолий.
Одним из пример ов существенного значения подвижности клеток для их функции является перемещение лимфоцитов в токе крови к местам воспаления или к местам метастазирования при онкологических болезнях. Вопрос о метаболической регуляции как этой, так и других функций клеток иммунной системы в настоящее время привлекает возрастающее внимание. В частности, интерес вызывает участие митохон-дриальных процессов окисления, а также гликолиза в осуществлении иммунными клетками специфических функций [1-4].
Большое внимание привлекает типичное отличие метаболизма раковой клетки от нормальной - доминирование гликолиза над дыханием.
Сокращения: СДГ - сукцинатдегидрогеназа, ЛДГ - лактатдегидрогеназа, ЛИИ - лейкоцитарные индексы интоксикации (подробная расшифровка в тексте), ИСЛК -индекс сдвига лейкоцитов, ИСНЛ - индекс соотношения нейтрофилов и лимфоцитов, И СЛМ - индекс соотношения лимфоцитов и моноцитов.
Это явление называется эффектом Вар бурга [5,6]. Оно противоположно эффекту Пастера, характерному для нормальных клеток, когда, наоборот, гликолиз подавляется дыханием.
Эффект Варбур га был откр ыт почти столетие назад, в настоящее вр емя наблюдается повышенный интерес к нему как к потенциальному биологическому показателю - маркеру развития опухоли в организме. Однако его невозможно использовать в клинике на биоптатах тканей ввиду увеличения риска развития нежелательной инвазивности в местах взятия био-птата.
Мы изучаем возможность использования цитохимического исследования активности ферментов дыхания и гликолиза в лимфоцитах крови, а также их отношения как показателя метаболизма, характерного для организма онкологических больных. Это исследование безопасно и безболезненно для больного. При подтверждении информативности этих показателей
они могли бы быть использованы в клинической практике.
В качестве показателя дыхания мы избрали активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) как наиболее мощного фермента окисления, активность которого определяет функциональное со -стояние клетки, а также обеспечивает устойчивость к опухолям. Напротив, снижение активности СДГ, в зависимости от его величины, приводит или к появлению опухолей, или, при сильном повреждении молекулы фермента, вызывает летальные опухоли у эмбрионов или на ранних этапах развития организма. Активность другого фермента, лактатдегидрогеназы (ЛДГ), является показателем гликолиза. Для более точной характеристики эффекта Варбур га мы рассчитывали отношение ЛДГ/С ДГ.
П ри исследовании лимфоцитов детей с онкологическими заболеваниями мы обнар ужили сильное влияние естественных метаболитов на структуру клеток, что и описано в настоящей статье.
Мы рассматриваем эту работу как пр одолжение традиции исследований в ИТЭБ РАН, заложенных акад. Г.М. Ф ранком, о неразрывной связи структуры и функций в клетках на микроскопическом уровне.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Определение активности ферментов окисления. И сследования проводили с использованием разработанной нами модификации цитохимического метода определения активности окислительных ферментов в лимфоцитах в мазке крови по восстановлению красителя нитроси-него тетразолия [7,8]. Именно благодар я мягкой фиксации структуры клетки на стекле цитохимические и гистохимические методы позволяют выявить те физиологические изменения активности ферментов, которые не могут быть обнаружены биохимическими методами. Для изучения митохондриальных процессов это осо-бенно важно, так как физиологическая регуляция осуществляется путем подвижного распада и сборки «нежной структуры» - митохондри-альной сети в клетке, которая объединяет митохондрии в общую систему. Однако пр еиму-щества фиксации структуры для исследований митохондрий терялись из-за использования устар евших ср ед инкубации. Замена in vitro компонентов среды веществами, более близкими к естественному окр ужению митохондр ий in vivo, позволила существенно улучшить выявление физиологической регуляции митохондриальных процессов в лимфоцитах в мазке крови. Этот метод, объединяющий достоинства цитохими-
ческого и биохимического методов, назван ци-тобиохимическим. Цитобиохимический метод выявляет большие изменения активности СДГ, ЛДГ и других окислительных ферментов при безболевом психоэмоциональном стрессе, гипертонии, метаболических болезнях [8,9]. Они обнаружены нами и пр и онкологических заболеваниях, в том числе у детей. Величины активности рассчитываются по восстановлению нитросинего тетразолия при компьютерной обработке микроскопических изображений [10].
Характеристики состояния организма. Со -стояние больных характеризовали набором клинических показателей, полученных в Центре детской гематологии, онкологии и иммунологии, а также р азными соотношениями лимфоцитов и нейтрофилов, опр еделяемыми в ИТЭБ РАН.
Лимфоцитарные индексы. Для общей оценки состояния организма больных и здоровых детей проводили клинический анализ крови с подсчетом лейкоформулы и определением интегральных лейкоцитар ных индексов. Мазки кро -ви окр ашивали по методу Романовского в модификации Паппенгейма [11]
Мы определяли следующие индексы (классификация по Т.В. Овсянниковой [12]).
1) индексы интоксикации - лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) по Я .Я. Кальф-Калифу (ЛИИк); модифицированный лейкоцитар ный индекс интоксикации (ЛИИм) В.К. Островского с соавторами; реактивный ответ ней-трофилов Т.Ш. Хабирова; индекс сдвига лейкоцитов (И С ЛК) по Н .И. Яблучанскому;
2) индексы неспецифической реактивности -лейкоцитарный индекс по Г.И. Казинцу и В.А. Монрову; индекс соотношения нейтрофилов и лимфоцитов (ИСНЛ) В.М. Угрюмова; индекс иммунореактивности Д.О. Иванова с соавторами; индекс аллергизации Т.В. Кобеца с соавторами; индекс соотношения лимфоцитов и моноцитов (И СЛМ);
3) индекс активности воспаления - лимфо-цитарно-гранулоцитарный индекс по И.С. Шевченко с соавторами.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика состояния обследуемых. Обнаруженное явление влияния метаболита на структуру лимфоцитов иллюстрируется примером мазков крови, взятых у больной девятилетнего возраста с опухолью яичника, в сравнении со здоровыми девочками в возрасте 5, 10 и 16 лет, обследованными в близкий календарный срок. Последнее условие мы считаем
Значения интегральных лейкоцитарных индексов здоровых группы сравнения и больной с опухолью яичников в р емиссии
Обследуемые Индексы интоксикации
Номер Возраст Диагноз ЛИИм ЛИИк ИСЛК Реактивный ответ нейтрофилов
1 16 Здорова 0,70 0,26 0,78 1,06
2 10 Здорова 0,96 0,20 1,2 1,25
3 5 Здорова 0,70 0,10 1,04 0,56
4 9 ОЯ 1,49 0,47 1,75 3,07
Обсле- Индексы стресса Индексы неспецифической р езистентности Индексы воспаления
дуемые, номер И СНЛ Индекс аллергизации Индекс иммунореактивности И СЛМ Лейкоцитарный индекс Лимфоцитарно-грану-лоцитарный индекс
1 0,80 1,85 10,90 10,40 1,25 11,66
2 1,24 1,79 7,49 6,65 0,81 7,26
3 0,99 3,00 7,04 5,74 1,01 8,20
4 2,03 1,01 4,72 4,3 0,49 4,64
важным для исключения разбр оса результатов, обусловленного сезоном, погодой и временем суток. За год до описываемого обследования больная перенесла операцию по удалению пораженного яичника. Операции предшествовали сеансы терапии по стандартным протоколам. До операции отмечались метастазы в брюшине, не обнар уженные во время операции после курсов тер апии. Диагноз на момент обследования -устойчивая ремиссия основного заболевания.
Для оценки общего со стояния о рганизма, в том числе иммунной системы, в данной группе детей мы определяли интегральные лейкоци-тар ные индексы. По совр еменным данным эти индексы, представляющие собой определенные сочетания показателей лейкограммы, отражают интегр альные характеристики гомеостатиче-ских систем организма и могут быть использованы для целей диагностики заболеваний, для оценки уровня стресса, эндогенной интоксикации, которыми сопровождаются многие заболевания, а также оценки общего адаптационного потенциала организма [13]. Результаты представлены в таблице.
Интегральные индексы, входящие в группу индексов интоксикации, такие как ЛИИм, ЛИИк, И СЛК, были в ср еднем в два раза выше у пациентки, чем у здоровых детей, а реактивный ответ нейтрофилов - в три раза. Это со -гласует
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.