ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 2, с. 267-274
УДК 581.1
ИЗМЕНЕНИЯ В ОБРАЗОВАНИИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ КАДМИЯ НА КАЛЛУСНЫЕ КУЛЬТУРЫ, ИНИЦИИРОВАННЫЕ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ
© 2007 г. Н. В. Загоскина, Е. А. Гончарук, А. К. Алявина
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 10.04.2006 г.
Изучали влияние кадмия (6.3 х 10-5 М или 10.6 х 10-5 М) на рост каллусных культур чайного растения (Camellia sinensis L.) листового, стеблевого и корневого происхождения, а также образование в них фенольных соединений, в том числе характерных для чая флаванов, и лигнина. Под влиянием кадмия у каллусов листового и стеблевого происхождения прирост биомассы снижался, в отличие от каллуса корневого происхождения, сохранявшего ростовые характеристики на уровне контроля. В этих условиях в листовом каллусе содержание фенольных соединений, в том числе и флаванов, уменьшалось, тогда как в стеблевом и корневом каллусах - либо повышалось (при концентрации кадмия 6.3 х 10-5 М), либо было близким к контролю (при концентрации 10.6 х 10 М). Количество лигнина увеличивалось в корневом и стеблевом каллусах и оставалось без изменений в листовом каллусе. Все это свидетельствует о том, что под влиянием кадмия происходили изменения в феноль-ном метаболизме каллусных культур чайного растения, зависящие как от концентрации тяжелого металла в среде, так и от происхождения каллусов.
Camellia sinensis - каллусные культуры - кадмий - фенолъные соединения - флаваны
ВВЕДЕНИЕ
В последнее время все большее внимание исследователей привлекает изучение действия различных стрессовых факторов, в том числе и тяжелых металлов, на жизнедеятельность растений [1, 2]. Одним из наиболее распространенных в природе поллютантов является кадмий, для которого характерна высокая подвижность в почвенном растворе и быстрое поступление в растения. При этом снижается транспорт метаболитов в листья и стебли, наблюдается их хлороз и угнетение роста [3-5]. Кадмий вызывает широкий спектр мутаций, включая точечные и хромосомные аберрации, а также изменения в морфологии ядра [6, 7]. Кроме того, он способствует возникновению окислительного стресса в растительных клетках, что влияет на активность ряда ферментов, в том числе супероксиддисмутазы, каталазы, оксидазы и др. [4, 8, 9]. Сообщалось также о замене металлов, входящих в металлобелковые комплексы растительных клеток, на кадмий и изменениях в биохимических процессах [5, 10-12].
Адрес для корреспонденции: Загоскина Наталья Викторовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-19; электронная почта: phenolic@ippras.ru
В то же время в растениях существуют и защитные системы, способствующие ослаблению токсического действия этого тяжелого металла на клетки. В частности, кадмий может выводиться через корневые волоски или "инактивировать-ся", накапливаясь в клеточных стенках и вакуолях [2, 13]. Следовательно, толерантность растений к действию кадмия - явление сложное, зависящее от внешних факторов и определяемое видом и возрастом растений [2, 7, 13, 14].
Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению влияния этого тяжелого металла на растительные организмы, до сих пор многие аспекты его действия не ясны. Это относится и к образованию фенольных соединений, являющихся одними из наиболее распространенных в растениях представителей вторичного метаболизма. Известно, что они способны взаимодействовать с металлами [15]. Кроме того, фе-нольные соединения проявляют антиоксидантые свойства, связывая активные формы кислорода и другие свободные радикалы, возникающие при действии многих стрессовых факторов [15, 16]. Все это свидетельствует о том, что эти вещества так называемого "вторичного происхождения" выполняют важные функции в клетках растений, в том числе способствуя сохранению их жизнеспособности в стрессовых условиях [17], к числу
которых можно отнести и присутствие в среде тяжелых металлов.
Удобными моделями при изучении клеточного метаболизма являются культуры in vitro. Их преимуществом по сравнению с интактными растениями является более простой уровень внутритканевой и внутриклеточной организации, а также возможность четко контролировать условия выращивания [18]. При этом в большинстве случаев клеточные культуры сохраняют способность к синтезу характерных для интактных тканей вторичных метаболитов [19, 20]. Это позволяет успешно использовать их для изучения фенольного метаболизма и его роли в жизни растений, в том числе и при адаптации к стрессовым условиям [7, 21]. Одним из удобных объектов для таких исследований являются каллусные культуры чайного растения, обладающие специализированным обменом, направленным на синтез различных соединений фенольной природы (фенил-пропаноидов, флавоноидов, лигнина) [22].
Целью нашей работы являлось сравнение ответа каллусных культур, инициированных из листа, стебля и корня чайного растения, на действие кадмия. Такой подход интересен тем, что клетки, выращиваемые в условиях in vitro, часто сохраняют эпигенетические характеристики, свойственные исходным эксплантам [18]. Поэтому сопоставление изменений в накоплении фенольных соединений у каллусных культур разного происхождения, вызванных присутствием в среде кадмия, в определенной степени позволит понять и реакцию клеток различных органов чайного растения.
МЕТОДИКА
В работе использовали каллусные культуры, инициированные из листьев, стеблей и корней проростков чайного растения (Camellia sinensis L., грузинская разновидность). Культуры выращивали в темноте на модифицированной питательной среде Хеллера, содержавшей 2,4-дихлорфенокси-уксусную кислоту (5 мг/л) и глюкозу (25 г/л) [23]. В опытных вариантах к питательной среде добавляли 6.3 х 10-5 М или 10.6 х 10-5 М кадмия (в виде нитрата). При этих концентрациях, согласно нашим предварительным данным, рост каллусов сохранялся, тогда как при более высоких концентрациях кадмия культуры погибали.
О характере роста культур судили по приросту свежей массы каллусов за период культивирования (45 дней; 8-кратная повторность). Размер исходных трансплантантов составлял 150-170 мг свежей массы. Содержание воды в ткани определяли после ее высушивания до постоянного веса при 70°С (3-кратная повторность).
Для извлечения фенольных соединений каллусы подвергали экстракции горячим 96%-ным этанолом. В этанольных экстрактах спектрофото-метрическим методом определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений с реактивом Фолина-Дениса (поглощение при 725 нм) и содержание флаванов - с 1%-ным раствором ванилина в 70%-ной серной кислоте (поглощение при 500 нм) [24]. Калибровочные кривые в обоих случаях строили по (-)-эпикатехину.
Для определения лигнина каллусные ткани подвергали последовательной экстракции этанолом, смесью этанол : бензол (1 : 2) и горячей водой (95°С, 2 ч) и в завершение промывали 96%-ным этанолом и эфиром. Полученный таким образом свободный от экстрактивных веществ остаток гидролизовали 0.5 N NaOH в течение 36 ч при 80°С. Охлажденный гидролизат центрифугировали (1000 g, 10 мин) и в надосадочной жидкости спектрофотометрически (при 610 нм) определяли содержание лигнина по реакции с 2,6-дихлорхинон-хлоримидом [25]. Калибровочную кривую строили по феруловой кислоте.
Для цитохимических исследований использовали срезы свежезамороженных каллусных тканей толщиной 30 мкм, полученные с помощью микро-тома-криостата (Россия). Локализацию флаванов определяли по реакции с ванилиновым реактивом, а локализацию лигнина - по реакции с флороглю-цином [22]. Препараты просматривали и фотографировали с помощью светового микроскопа Er-gavall (Германия).
В работе использовали 2,4-дихлорфеноксиук-сусную кислоту, ванилин, (-)-эпикатехин, феру-ловую кислоту, 2,6-дихлорхинонхлоримид, фло-роглюцин фирмы "Serva" (Германия); остальные реактивы квалификации "х. ч." и "ч." отечественного производства.
На рисунках представлены средние арифметические значения из трех определений и их стандартные отклонения. Для каждого определения использовали по 3 каллуса в трех аналитических повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Каллусные культуры чайного растения листового, стеблевого и корневого происхождения, выращиваемые на основной питательной среде, представляли собой медленно растущие плотные каллусы желтого цвета. У стеблевой культуры прирост свежей массы к концу пассажа был значительно выше, чем у корневой и, особенно, листовой культуры (рис. 1).
Определение содержания фенольных соединений выявило значительные различия в биосинтетической способности каллусных культур чайного растения (рис. 2). Наибольшее накопление сум-
600 § к 500
се и
« <3400 о н
| £300 В «Т 200 ^¡=100
С™ св
М
0
1 1 2
К
Вариант
Рис. 1. Прирост свежей массы каллусов корневого (1), стеблевого (2) и листового (3) происхождения под влиянием кадмия.
Возраст культуры 45 дней. К - основная питательная среда, I - 6.3 х 10-5 М кадмий, II - 10.6 х 10-5 М кадмий.
мы растворимых фенольных соединений отмечено у листового каллуса, а наименьшее - у корневого (различия между ними превышали 500%). У стеблевого же каллуса содержание фенольных соединений было в 3 раза ниже, чем у листового, и в 1.5 раза выше, чем у корневого каллуса.
Аналогичная тенденция характерна и для накопления флаванов - соединений, являющихся основными компонентами фенольного комплекса как интактного чайного растения, так и инициированных из него каллусных культур [23, 26]. Наибольшее их количество было обнаружено в листовом каллусе; в стеблевом каллусе оно было в 3 раза ниже, а в корневом составляло лишь 6 и 20% от такового в листовом и стеблевом каллусах соответственно (рис. 3). При этом у корневого каллуса, характеризующегося самой низкой биосинтетической активностью, на долю флаванов приходилось лишь 30% от суммарного содержания фенольных соединений, тогда как в остальных культурах - около 90% (рис. 2 и 3). Исходя из этого, можно предположить, что в каллусных клетках, инициированных из надземных органов (листа и стебля), синтез фенольных соедин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.