^^^^^^^^^^^^ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
СТАТЬИ
581.1
ИЗМЕНЕНИЯ В СОСТАВЕ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ ТОМАТА
ПРИ СОЛЕВОМ СТРЕССЕ
© 2007 г. Ф. Амини*, А. А. Эсанпур*, К. Т. Хоанг**, Дж. Ш. Шин**
* Отдел биологии, Факультет наук, Исфаганский университет, Исфаганъ, Иран
** Школа науки о жизни и биотехнологии, Корейский университет, Сеул, Корея
Поступила в редакцию 21.06.2006 г.
Исследование вызываемых солью изменений в протеоме с использованием двумерного гель электрофореза белков с высокой разрешающей способностью, идентификации белков масс-спектро-метрией и поиска в базах данных может позволить выявить наиболее важные гены. Томат (Lycoper-sicon esculentum Mill.) представляет собой удобное модельное растение для изучения механизмов со-леустойчивости растений. Семена томата сорта Shirazy проращивали на водно-агаровой среде. После прорастания проростки переносили на МС-среду, к которой добавляли 0, 40, 80, 120 и 160 мМ NaCl. Через 24 ч собирали образцы листьев и корней и экстрагировали из них белки, а также определяли сухой вес побегов. Изменения в составе белков, вызванные солью, сначала исследовали одномерным ДДС-электрофорезом в полиакриламидном геле. Белки листьев также анализировали двумерным электрофорезом (ДЭ). Сухой вес побегов снижался при увеличении концентрации соли в среде. ДДС-ПАГЕ обнаружил индукцию, по крайней мере, 5 белков: три белка с мол. м. 30, 62 и 75 кД в корнях и два белка с мол. м. 38 и 46 кД в листьях. На двумерных электрофореграммах можно было различить более 400 белковых пятен. По крайней мере, 18 из них изменялись под влиянием солевого стресса. Три из них были новыми белками, 6 белков накапливались и количество 5 белков снижалось при солевом стрессе. Синтез 4 белков листьев был полностью подавлен в присутствии соли. Десять пятен анализировали методом MALDI-TOF (от matrix-assistant laser desorption/ionization-time of flight), благодаря чему были идентифицированы некоторые белки, которые могут играть физиологическую роль при солевом стрессе. Экспрессия при солевом стрессе новых белков (эноил-КоА-гидратаза, гомолог рецептора эпидермального ростового фактора, белок солеустойчивости, гомолог фосфоглицерат-мутазы и белок M2D3.3) показывает, что клетки листьев томата отвечают на солевой стресс изменениями в разных физиологических процессах. Все идентифицированные белки как-то связаны с разнообразными ответными реакциями на солевой стресс, например, таким как пролиферация клеток.
Lycopersicon esculentum - двумерный электрофорез - солевой стресс - протеом - ДДС-ПАГЕ
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 526-533
УДК
ВВЕДЕНИЕ
Засоление подавляет рост растения, вредно для его развития, оказывает отрицательное влияние на его метаболизм и модифицирует экспрессию генов в нем. Эти модификации могут приводить к накоплению или истощению ряда метаболитов, приводя к изменениям в соотношении сравнительно небольшого набора клеточных белков, количество которых может возрастать
Сокращения: ДТТ - дитиотрейтол; ИРГ - иммобилизованный рН градиент; КАН - концентрированный ацетонитрил; РЭФР - рецептор эпидермального фактора роста; ТФК -трифторуксусная кислота; ФГМ - фосфоглицерат-мутаза; ФМСФ - фенилметилсульфанилфторид; CHAPS - цвиттери-онный детергент; MALDI-TOF - от matrix-assistant laser de-sorption/ionization-time of flight.
Адрес для корреспонденции: A.A. Ehsanpour. Department of Biology, Faculty of Sciences, Isfahan University, Isfahan, Iran. E-mail: ehsanpou@yahoo.com
или уменьшаться, которые могут появляться заново или исчезать при обработке солью [1]. Засоление почвы может приводить к двум типам стресса. Первый - это нарушение баланса питательных элементов из-за ионов соли и низкого водного потенциала почвы, влияющих как на процесс поглощения, так и на процесс транслокации. Второй - токсичность высоких концентраций и С1- в цитоплазме [2]. Засоление приводит к сложным взаимодействиям, влияющим на метаболизм растения и его чувствительность к повреждению [3]. Для противодействия этому вредному влиянию растение прибегает к разнообразным механизмам адаптации, таким как приспособление к новым осмотическим условиям, избирательное поглощение ионов, компартмента-ция ионов в цитозоле и вакуоле [4]. Однако молекулярные основы солеустойчивости разных видов растений пока не изучены [5].
У растений было идентифицировано несколько белков, индуцированных засолением [6]. Pa-reek с соавт. [7] предположили, что стрессовые белки можно использовать в качестве молекулярных маркеров при повышении солеустойчиво-сти методами генной инженерии. Однако не всегда белки, индуцируемые засолением, связаны с солеустойчивостью, и возможность их использования в качестве индикатора солеустойчивости зависит от вида или сорта растения.
Неоднократно сообщалось, что изменения в составе белков сопровождались изменениями в биологии адаптации, что приводило к лучшему соответствию организма к изменившимся условиям [8, 9]. Однако не всегда изменения в составе белков повышают солеустойчивость растений [10]. Протеомику применяли в разных областях биологии в связи с высокой разрешающей способностью двумерного электрофореза (ДЭ) белков и их индентификацией масс-спектрометрией и поиском в базах данных [11]. Изменения в составе белков зависят от органов растений и их видов [1]. Идентификация белков зависит от размера доступной информации, содержащейся в базах данных, относительно строения генома данного растения [12]. К настоящему времени геном полностью расшифрован только для двух растений, Arabidopsis thaliana и Oryza sativa. Поэтому поиск в базах данных облегчает задачи протеомики для видов растений, для которых известны последовательности многих генов, но мало полезен в случае видов с ограниченной информацией о геноме [11].
До настоящего времени не было опубликовано данных о протеомике томатов, подвергнутых засолению. В данной работе мы попытались оценить вызванные засолением изменения в составе белков у растений томата, используя одномерный и двумерный электрофорез и идентификацию белков масс-спектрометрией.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Семена томата (Lyco-persicon esculentum Mill., сорт Shirazy) получали из коллекции семян и проростков в Исфагани (Иран). Семена стерилизовали, погружая на 15 мин в раствор 5%-ного гипохлорита натрия (по объему), а затем трижды промывали стерильной дистиллированной водой. Затем семена проращивали в 8-сантиметровых чашках Петри на 0.8%-ном агаре, приготовленном на стерильной воде (рН 5.8, вес/объем). В каждую чашку помещали по 10 семян в 10 повторностях (всего 100) и помещали чашки в ростовой кабинет при освещении 90 мол/(м2 с) с 16-часовым фотопериодом при 26°С на 6 дней. Затем проростки переносили на МС-среду [13], к которой добавляли 0, 40, 80, 120 или 160 мМ NaCl, на 21 день. Для определения су-
хого веса растения высушивали при 75-80°С в течение 24 ч.
Экстракция белков для одномерного электрофореза. Примерно 1 г свежей ткани листьев или корней гомогенизировали сначала в жидком азоте, а затем в трех объемах буфера для экстракции (50 мМ Трис-HCl, 1 мМ фенилметилсульфанил-фторид (ФМСФ), 2 мМ ЭДТА 1 мМ 2-меркапто-этанол, рН 7.5) и оставляли при встряхивании на 1-4 ч при 4°С. Гомогенат центрифугировали при 14000 об./мин в течение 25 мин при 4°С. Суперна-тант собирали и смешивали с тремя объемами холодного ацетона. Смесь выдерживали 20 мин при -20°С и затем центрифугировали при 14000 об./мин в течение 15 мин при 4°С. После этого суперна-тант удаляли, а осадок высушивали на воздухе при комнатной температуре и затем ресуспенди-ровали в малом объеме буфера для экстракции и центрифугировали при 14000 об./мин в течение 5 мин при 4°С. Наконец, супернатант подготавливали для определения белка методом Bradford [14] и разделением в ДДС-ПАГЕ.
Экстракция белков для двумерного электрофореза. Экстракт листьев готовили по методу Tsugita и Kamo [15]. Листья растирали в ступке в жидком азоте и инкубировали в холодном ацетоне, содержавшем 10%-ную (вес/объем) ТХУ и 0.07%-ный (вес/объем) дитиотрейтол (ДТТ) в течение 2 ч при -20°С. Коагулированный белок осаждали центрифугированием при 35 000 об./мин в течение 30 мин при 4°С. Осадок промывали ледяным ацетоном, содержавшим 0.07%-ный (вес/объем) ДТТ, 1 мМ ФМСФ и 2 мМ ЭДТА, чтобы удалить пигменты и липиды. Осадок высушивали под вакуумом, ресуспендировали в буфере для образца (9.9 М мочевина, 2 М тиомочевина, 4%-ный фенилметилсульфанилфторид (CHAPS), 100 мМ ДТТ и 2%-ный ИРГ-буфер (с иммобилизованным рН градиентом)) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 45000 g в течение 30 мин при 20°С. Общую концентрацию белка определяли методом Bradford [14], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.
ДДС-ПАГЕ. Одномерный электрофорез при денатурирующих условиях проводили в 12.5%-ном разрешающем и 5%-ном концентрирующем геле, используя PROTEIN II Multi Cell ("BioRad", США) по методу Hames и Rickwood [16]. Электрофорез продолжался 6 ч при комнатной температуре (20°С) и постоянной силе тока (80 мА), пока введенная краска не достигала конца геля. После электрофореза гель окрашивали Кумасси голубым по методу Reed [17, с. 103-108]. Для определения относительных молекулярных масс использовали стандартные белки.
Двумерный электрофорез общего белка. Для
изоэлектрофокусировки в полосках геля с ИРГ (рН 3-10) длиной 24 см использовали прибор IPGphor и полоски геля от "Amersham Pharmacia Biotech" (США). Полоски геля регидратировали 450 мкл буфера, содержавшего 9 М мочевину, 0.5%-ный CHAPS, 2%-ный ИРГ-буфер, рН 3-10, 60 мМ ДТТ, 0.003%-ный бромфенол синий и 100150 мкг белка. Чтобы облегчить проникновение высокомолекулярных белков в полоски геля, их сначала регидратировали в течение 5 ч, не включая ток, а затем выдерживали 7 ч при 30 В. Напряжение тока при изоэлектрофокусировке было сначала 300 В в течение 30 мин, затем 500 В в течение 1 мин и 8000 В в течение 45 мин (с постепенным усилением) и, наконец, еще 9 ч при 8000 В. Затем полоски геля уравновешивали 20 мин в растворе, содержавшем 6 М мочевину, 50 мМ Трис-HCl, pH 6
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.